基于网络药理学的精覆力骨合剂治疗骨质疏松症的机制研究

闫起，姜北，杨波，梁华，李泽光，赵福红，陈鑫，郑时嘉，周忠光※

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040；3.牡丹江市第二人民医院，黑龙江牡丹江157000；4.天问山农业综合开发股份有限公司，黑龙江哈尔滨150323）

骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种常见的骨代谢性疾病[1]，会引起骨矿物质与骨基质的丢失，造成骨密度降低、骨微结构损坏，进而导致骨强度下降，骨折风险增加，严重影响全球数亿患者的生活质量[2]。OP亦是我国老年人常见的主要慢性疾病之一[3]。OP的发生与多种因素相关，如人种、性别、年龄、营养、内分泌和免疫等[4]。病理机制可以归纳为骨重建的平衡失调，出现骨吸收大于骨形成。现阶段OP的治疗目的是尽可能减少骨吸收、增加骨形成。临床常用治疗手段包括非药物治疗（运动、增加钙摄入及戒烟酒等）与药物治疗（基础治疗药物、抗骨吸收药物、促骨形成药物、双重调节药物及中药等）[5]。中医古籍里并没有记载“骨质疏松症”这一具体病名，但却有与其症状相类似的“骨极”、“髓枯”和“骨痿”等描述。中医学认为其病变主脏在肾，疾病性质属虚证，病机以精血亏虚为主[6]。

黄精获天地之淳精，自古以来就是益寿遐龄之上品，甚至有“久服成仙”之传说[7]，更有“仙人余粮”之美誉。现代药理研究证实，黄精具有调节免疫、提高记忆力、抗氧化、抗衰老、抗疲劳及抗OP等多种作用[8]。精覆力骨合剂源于周忠光教授经验方，以黄精为君药，针对OP的中医病因病机遣药配伍而成，由黄精、覆盆子、黑芝麻、牡蛎、芡实、党参和丁香组成，具有补益肝肾、健脾益气和固本壮骨的功效，用于原发性骨质疏松症和骨量减少，症见腰背肢体疼痛、无力，在缓解OP症状、控制疾病进展等方面具有较好的疗效。但关于精覆力骨合剂治疗OP的作用机制尚不明确，需要不断探索，深入挖掘，所以基于网络药理学的科学研究方法，对精覆力骨合剂抗OP作用机制进行探析具有十分重要的意义。

1 资料与方法

1.1 精覆力骨合剂所含活性成分的筛选

TCMSP数据库内搜索黄精、覆盆子、黑芝麻、牡蛎、芡实、党参及丁香等中药所含化合物。根据药物进入机体内所需经历的ADME过程，以生物利用度（Oral bioavailability）≥30%，类药性（Drug-likeness）≥0.18为筛选条件，过滤后获得活性成分。

1.2 精覆力骨合剂潜在靶标基因与OP相关靶标基因的确定

TCMSP数据库内检索和已获得活性成分相匹配的潜在靶标基因。使用Uniprot数据库的UniprotKB模块，限定物种为“human”，对已经获得的有关蛋白或基因名称进行校对。使用Genecards与OMIM数据库，分别进行以“osteoporosis”为主题词的检索，获取OP治疗的已知靶标基因。

1.3 精覆力骨合剂活性成分靶标基因与OP已知治疗靶标基因相关网络的构建

将精覆力骨合剂潜在靶标基因与OP已知治疗基因相交，两者的交集即是复方治疗OP的靶标基因，而与交集基因相匹配的活性成分即为有效成分。利用Venny在线平台，同样将精覆力骨合剂潜在靶标基因与OP已知治疗基因相交，绘制韦恩图。使用Cytoscape3.7.2，构建相互作用网络。

1.4 蛋白互作网络的构建与关键节点的筛选

在STRING平台，输入疾病靶点基因与药物效用基因，以“Homosapiens”为物种，进行蛋白互作分析，置信度设置为0.4，隐藏游离蛋白，得到PPI图。对STRING所得PPI网络文件使用Cytoscape3.7.2做进一步可视化处理，计算节点属性值，以Degree、combined_score值调节图中节点、边的可视化效果（节点由小到大，颜色由暗到亮表示Degree值由小到大；边由粗到细，颜色由暗到亮表示combined_score值由小到大）。以节点degree值为指标，筛选出关键节点核心基因。运行R 4.0.2软件绘制柱状图。

1.5 网络拓扑分析

将交集基因导入Cytoscape3.7.2，使用软件中的Bisogenet及CytoNCA插件进行网络拓扑分析，对所得网络计算所有节点Degree中位数，以＞2倍中位数为筛选条件，得到Hithubs网络。进一步分别计算Hithubs网络中节点Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC和Network中位数，以＞1倍中位数为筛选条件，得到核心子网络。

1.6 Gene Ontology分析及KEGG通路富集分析

使用R 4.0.2软件中的Bioconductor包进行Gene Ontology（BP、MF和CC）分析及KEGG通路富集分析，以P≤0.5、q≤0.5为具有统计学意义，经过筛选后输出结果，进行条形图与气泡图的可视化绘制。

2 结果

2.1 精覆力骨合剂活性成分与潜在靶标基因

经筛选后得到12个黄精的活性成分及149个成分-基因对应关系；7个覆盆子的活性成分及286个成分-基因对应关系；7个黑芝麻的活性成分及48个成分-基因对应关系；2个芡实的活性成分及23个成分-基因对应关系；21个党参的活性成分及214个成分-基因对应关系；6个丁香的活性成分及309个成分-基因对应关系。复方中有不同药物包含相同活性成分的情况，去重后保留49种活性成分（见表1）。对已经获得的有关基因名称进行校对后，得到905个成分-基因对应关系，有不同活性成分对应于同一个靶基因的情况，去重后保留220个靶标基因。

表1 精覆力骨合剂活性成分Table 1 Active ingredients contained in the Jing Fu Ligu Mixture

续表1

2.2 OP治疗靶标基因

使用Genecards与OMIM数据库分别进行以“osteoporosis”为主题词的检索，获取OP治疗的已知靶标基因共4 133个，剔除重复者，最后保留4 122个。

2.3 精覆力骨合剂活性成分靶标基因与OP已知治疗靶标基因交集

将220个靶标基因与4 122个治疗基因相交，得到的153个交集即是精覆力骨合剂治疗OP的靶标基因，见表2；与之相匹配的39个活性成分即是复方治疗OP的有效成分，见表3。利用Venny在线平台绘制韦恩图，见图1。

图1 精覆力骨合剂-OP交集基因韦恩图Fig.1 The Venn map of the Jing Fu Ligu Mixture-osteoporosis intersection gene

表2 精覆力骨合剂治疗OP的靶标基因Table 2 The intersection gene of Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

表3 精覆力骨合剂治疗OP的有效成分Table 3 Effective ingredients of Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

续表3

2.4 精覆力骨合剂-OP靶标相关网络

使用Cytoscape3.7.2软件，输入数据文件，构建相互作用网络，见图2。图2的中间位置蓝色三角形代表靶基因，椭圆形代表药物活性成分，红色表示多味药物，黄色表示黄精，绿色表示覆盆子，灰色表示黑芝麻，橙色表示党参，粉色表示芡实，紫色表示丁香。

图2 精覆力骨合剂-OP可视化网络Fig.2 The JingFuLiguMixture-osteoporosisvisualization network

2.5 蛋白互作网络

所得PPI共有153个节点、2 924条边，平均节点度为38.2，平均局部聚类系数为0.62，见图3。对PPI网络文件使用Cytoscape3.7.2做进一步可视化处理，计算节点属性值，以Degree、combined_score值调节图中节点、边的可视化效果（节点由小到大，颜色由暗到亮表示Degree值由小到大；边由粗到细，颜色由暗到亮表示combined_score值由小到大），见图4。以节点degree值为指标，筛选出前30个关键节点核心基因，运行R 4.0.2软件绘制柱状图，见图5。Degree值排名前30位的核心节点分别为AKT1、IL6、ALB、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK8、EGF、MMP9、PTGS2、MAPK1、EGFR、MYC、ESR1、FOS、CCND1、IL1B、MMP2、CCL2、MAPK14、HSP90AA1、AR、ERBB2、CAT、CYCS、RELA、MTOR、BCL2L1、CTNNB1和PPARG，这些蛋白是精覆力骨合剂治疗OP的关键蛋白。

图3 精覆力骨合剂-OP的PPI核心网络（置信度＞0.4）Fig.3 The core net work of interaction between the Jing Fu Ligu Mixture and osteoporosis protein

图4 精覆力骨合剂-OP的PPI核心网络Cytoscape可视化（置信度＞0.4）Fig.4 The core net work Cytoscape visualization of interaction between the Jing Fu Ligu Mixture and osteoporosis protein

图5 核心蛋白柱状图Fig.5 The core protein histogram

2.6 网络拓扑分析

共得到7 352 Nodes、162 016 edges。经过＞2倍中位数筛选后，得到2 082 Nodes、85 445 edges即为Hithubs网络。进一步经过＞1倍中位数筛选后，得到655 Nodes、29 560 edges即为核心子网络，见图6。靠前的节点即为精覆力骨合剂治疗OP的核心靶基因，degree值排名前30的靶基因依次为APP、NTRK1、EGFR、CUL3、XPO1、HSP90AA1、TP53、ESR1、MCM2、UBC、FN1、CDK2、HSP90AB1、COPS5、RNF2、MYC、CUL7、CUL1、SIRT7、GRB2、CAND1、OBSL1、NPM1、YWHAZ、ITGA4、VCP、CCDC8、CDC5L、FBXO6和TRAF6。

图6 网络拓扑分析Fig.6 The network topology analysis

2.7 Gene Ontology分析

经BP、CC和MF分析后各得到2 070条、71条和141条结果，选择其中较关键者进行分析，进行前20个条目的条形图与气泡图的可视化绘制，见图7。GO Biological Process（BP）主要涉及细胞对化学应激的反应、对类固醇激素的反应、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对氧化应激的反应、对营养水平的反应、对金属离子的反应、对活性氧的反应、对抗生素的反应和细胞对氧化应激的反应等。GO Cellular Component（CC）主要涉及膜筏、膜微区、膜区、转录调节复合物、囊泡腔、分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔、核染色质、RNA聚合酶II转录调节复合物和小窝等。GO Molecular Function（MF）主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶II特异性、DNA结合转录激活因子活性、血红素结合、四吡咯结合及磷酸酶结合等。

图7 精覆力骨合剂治疗OP关键靶点的BP分析barplot与dotplot图Fig.7 The barplot and dotplot diagrams of the GO Biological Process analysis of key Targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

图8 精覆力骨合剂治疗OP关键靶点的CC分析barplot与dotplot图Fig.8 The barplot and dotplot diagrams of the GO Cellular Component analysis of key Targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

图9 精覆力骨合剂治疗OP关键靶点的MF分析barplot与dotplot图Fig.9 The barplot and dotplot diagrams of the GO molecular Function analysis of key targets of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

2.8 KEGG分析

经过筛选后输出结果，共得到145条结果，选择其中较关键者进行分析，进行前20个条目的条形图与气泡图的可视化绘制，结果见表4、图10和图11。

图10 精覆力骨合剂治疗OP关键靶点富集信号通路barplot与dotplot图Fig.10 The barplot and dotplot diagrams of the signal pathway of the key target enrichment of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

表4 精覆力骨合剂治疗OP的关键信号通路Table 4 The key signaling pathways of the Jing Fu Ligu Mixture in the treatment of osteoporosis

3 讨论

黄精自古以来就被奉为抗衰扶羸之圣药，以“九蒸九晒”的炮制方法使用最为广泛，增其厚重之气，克其湿腻之性，强其补益之效[9]，达增效、减毒、缓性之目的[10]。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功[11]。可疗诸虚，止寒热，安五脏，补五劳七伤，填精髓，助筋骨。临床应用广泛，亦是诸多中医经典方剂的重要组成药物。虽然目前已有相关研究证实或间接证实黄精具有抗OP作用，但是以黄精作为君药的中药复方制剂治疗OP的研究尚未见报道。周忠光教授遵循中医理论，启迪于经典名方，传承精华，守正创新，以黄精为君药，针对OP的病因病机，施以补肾健脾，益气生血，养阴助阳之法，创制中药复方——精覆力骨合剂，用于OP的治疗。该方由黄精、覆盆子、黑芝麻、牡蛎、芡实、党参和丁香组成。方中黄精性平，味甘，归肾、脾、肺经，补诸虚，填精髓，益脾胃，润心肺，使五劳七伤得补，筋骨得健，肌肉得充，为君药。臣以覆盆子、黑芝麻和牡蛎。覆盆子性微温，味甘酸，入肝肾经，固精缩尿，益肝肾明目，以其温补之性益肝补肾，强筋壮骨，使精血旺盛，骨得髓养，筋得血濡，经脉得充，筋骨坚强。黑芝麻味甘，性平，入肝肾大肠经，功能补益精液，润肝脏，养血舒筋，益气力，长肌肉，填脑髓。牡蛎味咸，性微寒，入肝肾胆经，潜阳补阴，收敛固涩，以补肾正气，除虚劳乏损。三药相须为伍，效力陡增，使肝肾得补，肾精得固，以治病求本。佐以芡实、党参、丁香三药。芡实味甘、涩，性平，归脾、肾经，益精气，固肾气，且能健脾除湿以止泻。党参味甘，性平，归脾、肺经，补中益气，补血，生津。丁香味辛，性温，归脾、胃、肺、肾经，辛温芳香，以行气滞，疗肾气，暖腰膝，壮阳，起痿。纵观全方，组方精当，配伍严紧，标本兼顾，使肝肾之精血得补，气血营卫得充，筋脉骨骼得利，骨痿之诸症得愈。

精覆力骨合剂治疗OP的有效成分有39个，如Quercetin、DFV（liquiritigenin）、beta-sitosterol、diosgenin和kaempferol等。Quercetin属于天然黄酮类物质，具有广泛的生物活性。Sok Kuan Wong等[12]对Quercetin的骨保护作用进行回顾性综述，指出Quercetin可以对由RANKL介导的OC分化、OB凋亡、氧化应激及炎症反应等具有抑制作用，对成骨、血管生成、抗氧化、脂肪细胞凋亡和OC凋亡等具有促进作用。其所涉及的机制包括对Wnt、NF-B、Nrf2、SMAD、MAPK以及凋亡相关信号转导途径的调节。Shashi chauhan等[13]研究提示，beta-sitosterol可以影响体外OB的活性与增殖，在体内可以通过雌激素的调节而改善OP状态。另外，beta-sitosterol还能增加OB的骨保护素（OPG）表达，同时减少核因子-B受体活化因子配体（RANKL）的表达，使OPG/RANKL的比值提高，产生骨保护的功能[14]。Zhang zhiguo等[15]研究发现，diosgenin可以通过介导Wnt，PI3K，RANK/RANKL或破骨因子途径中重要分子的表达，抑制OC生成，从而影响骨代谢。Liu Hao等[16]研究证实，kaempferol可以提高因去卵巢导致的骨丢失模型大鼠的骨密度，并且能促进BMSCs的成骨分化，上调RUNX2、Osterix和CXCL12的表达，下调miR-10a-3p表达，发挥抗OP的作用。

精覆力骨合剂治疗OP的核心靶点基因众多，如VEGFA、MMP9、ESR1、FOS、MMP2、RELA和TRAF6等。VEGF是调节血管发育和血管生成的重要生长因子[17]。由于骨骼是高度血管化的器官，血管生成在成骨中起着重要作用，因此VEGF也影响骨的发育与修复。Watson E C等[18]指出血管内皮细胞具有重要的信号传导功能，可以控制周围组织及器官的生长、稳态与再生。对于骨骼系统，其可以通过为造血干细胞提供血管壁来调节骨的发育、再生。ESR1/ER是雌激素发挥骨代谢调节作用的重要介质，在骨组织中广泛表达[19]。通过ESR1的介导，雌激素可以作用于OB、OC，促进OB的增殖与分化，抑制OC活性并促进凋亡[20]。MMP在ECM和组织重构、器官发生发育、血管形成、免疫炎症、细胞迁移、增殖和细胞凋亡等生理和病理过程中发挥重要作用，而骨基质中存在的MMP与骨的生长、发育和重建密切相关[21]。在骨代谢中，首先由MMP2启动骨转换，随后激活MMP9，在MMP2及MMP9的作用下水解部分降解的Ⅰ型胶原及其他多种骨基质蛋白，骨盐因失去依附而丢失，发生OP[22]。RELA（P65）属于NF-B家族的一员，NF-B家族共有5个成员：NF-B1（P50）、NF-B2（P52）、RelA（P65）、RelB和c-Rel。RelA可以与P50通过Rel同源域（RHD域）相互作用，形成二聚体，激活NF-kB信号通路，参与OC分化过程[23]。

精覆力骨合剂治疗OP所涉及的信号通路有IL-17信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、破骨细胞分化、MAPK信号通路、NF-B信号通路、VEGF信号通路和Wnt信号通路等。IL-17作为炎性因子能够对T细胞、巨噬细胞等多种不同细胞进行诱导而直接产生RANKL，亦或是通过刺激相关细胞使IL-1、IL-6及TNF-等分泌增加，间接促进RANKL的产生[24]，通过RANKL-RANK的信号转导，调控OC的增殖与分化，其还可以抑制OPG的表达，使RANKL/OPG值升高，打破骨代谢的平衡状态，促进骨吸收[25]。TNF（肿瘤坏死因子）在免疫及炎症性骨破坏中发挥重要作用。通常作用于OC以外的其他细胞类型，或与RANKL协同作用以间接促进OC生成和骨吸收[26]。HIF1信号转导可以诱导血管生成-骨生成偶联，HIF1可以上调VEGF的表达，增加骨组织内的血管生成，促进血管网络发育，使局部微循环血供丰富，调节骨代谢[27]。破骨细胞分化途径十分繁杂，其中包含由RANKL介导的多条经典信号途径，如OPG/RANKL/RANK、RANKL/TRAF6/NF-B、RANKL/TRAF6/MAPKs和JAK2/STAT3/RANKL等。另外如IL-1、TNF-等炎性细胞因子、M-CSF等均参与到OC的分化过程中[28]。MAPK信号转导的特点是经过MAPKKK-MAPKK-MAPK三级激酶磷酸化反应，参与细胞增殖、分化、凋亡以及细胞相互传导功能等进程，包含ERK1/2/5、JNK、p38等多条转导途径[29]，其中以ERK1/2和p38MAPK信号转导与OB增殖、分化关系最为密切，向下影响Runx2以及成骨相关基因的表达[30,31]。Wnt信号通路包括经典的Wnt/-catenin信号转导以及非经典的Wnt/Ca2+信号转导和Wnt/Planar cell polarity信号转导。经典的Wnt/-catenin能够促进OB的增殖、分化，而且对于OPG/RANKL/RANK信号通路亦有调控作用，通过抑制RANKL的表达、上调OPG的表达，间接影响OC的功能[32]。Wnt/-catenin还可以促进MSCs向OB分化，激活转录因子Osterix的表达，促进成骨[33]。

综上所述，精覆力骨合剂能够通过抗炎、改善骨微环境、调节成骨与破骨平衡、抑制OB凋亡和促进OC凋亡等多种机制调节骨代谢，发挥治疗OP的作用。本研究依托“网络靶标”理论，从网络药理学角度探析精覆力骨合剂的有效成分及作用靶点，结合生信数据分析，借助现代科学研究工具，对所得数据进行统计分析与可视化，契合中医药研究所具有的非线性的开放性复杂体系特点，探讨精覆力骨合剂治疗OP的多靶点整体调节作用机制，分析潜在效用靶点及信号通路，为临床应用黄精及以其为君药的复方-精覆力骨合剂治疗OP提供理论支持，为拓展传统保健中药黄精的临床新用奠定基础，同时也为进一步的实验研究提供依据与思路。