基于网络药理学和分子对接探讨射干麻黄汤治疗哮喘的药效物质及作用机制

郭文军，韩雨晴，黄凤辉，徐晓航，解生旭，刘悦，徐雅娟※

（1.长春中医药大学，吉林长春130117；2.吉林省中医药科学院，吉林长春130012；3.葵花药业集团（吉林）临江有限公司，吉林白山134600）

哮喘是一种慢性疾病，主要特征是由气道高反应性和炎症引起的间歇性喘息、咳嗽和呼吸困难[1]。尽管医学科学发展迅速，但哮喘仍然困扰着许多儿童和成人[2]。糖皮质激素类、抗胆碱能药物是西医治疗哮喘的首选药，但只能减轻哮喘发作症状、减少发作次数，并且大量使用上述药物容易导致多种不良反应[3,4]。射干麻黄汤出自《金匮要略》卷上，具有温肺化饮，下气祛痰之功效[5]。现代药理学研究表明射干麻黄汤可以通过祛痰、抗炎和气道重塑治疗哮喘[6,7]，但中药具有多组分协同发挥作用的特点，基于单一靶点研究作用机制具有很大局限性。网络药理学“整体观”与“辨证论治”的研究思维符合中药多组分、多靶点及多途径的治疗机制，其研究方法通过蛋白质与化合物相互作用基础上建立，是开发中药活性成分、探索中药作用机制的强有力手段[8,9]。本课题组前期完成了射干麻黄汤制剂研究，建立了大鼠哮喘模型进行药效研究，结果证明射干麻黄汤可减轻支气管炎症浸润程度、气道炎症反应及对肺脏病理损伤而达到治疗哮喘作用，但基于大鼠等动物模型的射干麻黄汤的网络药理学分析未见报道[10,11]，本文选择物种为“大鼠”通过网络药理学和分子对接技术分析探讨射干麻黄汤治疗哮喘的药效物质基础和作用机制，并进行分子模拟辅助验证，为后续开展射干麻黄汤药效物质基础和作用机制的动物实验研究提供参考。

1 实验方法

1.1 射干麻黄汤有效成分筛选

中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP：https://tcmspw.com/tcmsp.php/）是一个独特的中药系统药理平台，可捕获药物、靶点和疾病之间的关系[12]，利用TCMSP检索射干麻黄汤中半夏、大枣、款冬花、麻黄、射干、生姜、五味子、细辛和紫菀含有的化合物，并设置化合物的口服利用度（OB≥40%）、类药性（DL≥0.2）和半衰期（HL≥4）筛选射干麻黄汤有效成分。

1.2 有效成分作用靶点预测

Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisst argetprediction.ch/）是一个根据有效成分与数据库中已知活性物质2D和3D结构的相似度来预测有效成分作用靶点的web服务器。利用TCMSP和pubchem数据库获取射干麻黄汤有效成分的mol2格式的结构文件或Canonical SMILES结构式，导入Swiss Target Prediction数据库，选择物种为“大鼠”来获取有效成分作用靶点，Probability*值大于0的靶点即为有效成分的作用靶点。

1.3 有效成分―靶点―哮喘（C-T-D）网络构建及关键活性成分获取

以“asthma”为关键词在Gene cards数据库（https://www.genecards.org/）中获取哮喘的治疗靶点，其中Relevance score≥2倍中位数的靶点被视为治疗哮喘的靶点。利用Venn分析将哮喘的治疗靶点和有效成分作用靶点取交集得射干麻黄汤对哮喘的治疗靶点，将具有活性成分、哮喘以及治疗靶点信息的数据集导入Cytoscape软件进行C-T-D网络图构建和可视化，根据节点度的大小对网络进行拓扑分析，并根据“节点度＞中位数”筛选出射干麻黄汤关键活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）网络构建及关键靶点的获取

PPI网络作为一种新的药物研究方法，可用于阐明预测目标与其他蛋白之间的关系。String数据库（https://string-db.org）是用于搜索蛋白质相互作用的数据库，它提供有关蛋白质预测和相互作用的信息。利用String数据库构建射干麻黄汤治疗哮喘靶点的PPI网络，并通过Cytoscape软件进行可视化，随后将关键活性成分映射在PPI网络图中构建关键活性成分―PPI网络图，图中靶点连接度越大，与它连接的蛋白或活性成分就越多，它在哮喘发生和发展中可能发挥的作用就越重要，据此筛选关键活性成分作用的关键靶点。

1.5 功能富集分析

DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）是对基因提供一套全面功能注释，以了解大量基因背后的生物学含义的工具。将PPI网络图中的靶点导入DAVID数据库，选择物种为“大鼠”，以P＜0.05为条件进行KEGG Pathway、生物学过程（biological process,BP）、细胞组成（cell composition,CC）、分子功能（molecular function,MF）富集。

1.6 分子对接

从RSCB PDB数据库（http://www.rcsb.org）下载目标靶点结构，并使用PyMOL软件去除靶点结构的结晶水和其他小分子，并将其保存为pdb格式，然后将结构文件放入AutoDockTool 1.5.6程序中，添加原子电荷，并在添加氢原子后将其保存为pdbqt格式。将射干麻黄汤关键活性成分的mol2格式的结构文件放入AutoDockTool程序，添加原子电荷并将其保存为pdbqt格式作为对接配体。使用Autodockvina软件模拟分子对接，以确定目标蛋白与潜在生物活性成分的结合亲和力。这些生物活性成分与靶蛋白之间的结合亲和力被用作评估标准，结合亲和力越小，结合能力越强。

2 结果与分析

2.1 射干麻黄汤活性成分及其作用靶点

通过TCMSP数据库搜索了射干麻黄汤中各味中药的化学成分，并通过OB、DL和HL 3个药代动力学参数筛选出了射干麻黄汤的93个有效成分，其中麻黄、射干、款冬花和大枣为射干麻黄汤贡献了多数活性成分。将射干麻黄汤的93个有效成分依次导入SwissTarget Prediction数据库共获得84个有效成分的3 263个靶点，去重复后得到465个有效成分作用靶点。

2.2 C-T-D网络构建及关键活性成分

在Gene cards数据库中1 475个靶点被筛选为哮喘的治疗靶点，这些靶点与有效成分作用靶点取交集得有效成分治疗哮喘的靶点。将有效成分、有效成分治疗哮喘的靶点和哮喘导入Cytoscape构建了C-T-D网络图进行可视化（图1），该网络图是由169个节点和1 009条边构成，其中包含哮喘、99个有效成分治疗哮喘的靶点和69个有效成分，将有效成分节点的大小按照其连接度大小绘制，并筛选出消旋卡文定碱、黄芩素及白藜芦醇等22个治疗哮喘的关键活性成分，详细信息见表1。

图1 活性成分-靶点-哮喘（C-T-D）网络图Fig.1 The active ingredient-target-asthma(C-T-D)network diagram

表1 射干麻黄汤治疗哮喘关键活性成分Table 1 Active ingredients for various medicinal materials of Shegan Mahuang Decoction

续表

2.3 蛋白互作（PPI）网络构建及关键靶点

利用String数据库构建射干麻黄汤治疗哮喘靶点的PPI网络，随后将关键活性成分映射在PPI网络图中构建“关键活性成分-PPI网络图”（图2），根据靶点连接度的大小筛选出前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin H Synthase-2,Ptgs2）、过氧化物酶体增生激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,Pparg）、腺苷A1受体（adenosine A1 receptorAdora1）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（protein kinase B,Akt1）等15个射干麻黄汤治疗哮喘的关键靶点。

图2 射干麻黄汤治疗哮喘的关键活性成分-PPI网络图Fig.2 The key active ingredients of Shegan Mahuang Decoction in the treatment of the asthma-PPI network diagram

2.4 功能富集和作用通路富集

将PPI网络图中的射干麻黄汤治疗哮喘的靶点导入DAVID数据库，选择物种为“大鼠”，以P＜0.05为条件，进行KEGGPathway、BP、CC和MF分析。如图3 A所示，这些靶点主要参与胞质钙离子浓度的正调节、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、炎症反应和腺苷酸环化酶活性的负调节等生物学过程；细胞组成为质膜、轴突末端和神经元胞体等；主要发挥G蛋白偶联腺苷受体活性、肾上腺素结合、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性、多巴胺神经递质受体活性和花生四烯酸15-脂肪氧化酶活性等细胞功能。如图2所示，这些靶点主要参与钙信号通路、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）信号通路、色氨酸（tryptophan,TRP）通道的炎症介质调节、环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）-蛋白激酶G（protein kinase G,PKG）信号通路、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路和磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）信号通路等。推测射干麻黄汤中消旋卡文定碱、黄芩素和白藜芦醇等22个治疗哮喘的关键活性成分通过Ptgs2、Adora1、Pparg和Akt1等15个靶点参与上述信号通路中发挥治疗哮喘的作用。

图3 射干麻黄汤作用靶点的：生物学过程、细胞组成、分子功能富集（A）；KEGG Pathway富集分析（B）Fig.3 The target of Shegan Mahuang Decoction:biological process,cell composition,molecular function enrichment(A);KEGG Pathway enrichment analysis(B)

2.5 分子对接

选取射干麻黄汤治疗哮喘的关键活性成分-PPI网络图中连接度前四名的靶点进行分子模拟，如表1所示，首先分别选取靶点的阳性药进行分子对接，获取各自阳性药与靶点的亲和能力，随后将射干麻黄汤中22个关键活性成分的mol2格式的结构文件放入到Auto-DockTool程序中进行分子模拟，结果显示关键成分均能与转位因子蛋白（translocator protein,Tspo）、Ptgs2、Pparg和Adora1进行结合，其中消旋卡文定碱与Adoral、Ptgs2和Tspo靶点的结合能力大于阳性药，anhydrobelachinal和epianhydrobelachinal与Ppary的结合能力最强，其中消旋卡文定碱展现出极强的结合能力，提示该化合物在治疗哮喘中发挥重要作用。

表2 射干麻黄汤关键活性成分与关键蛋白进行结合能力Table 2 The binding ability of key active ingredients of Shegan Mahuang Decoction and key proteins

3 讨论

TCMSP数据库搜索了射干麻黄汤中各味中药的化学成分，并通过药代动力学参数筛选出93个有效成分，通过构建C-T-D网络图筛选出消旋卡文定碱、黄芩素和白藜芦醇等22个治疗哮喘的关键活性成分。已证明消旋卡文定碱可抑制促炎细胞因子、肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-,TNF-）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的产生以及NF-B信号通路的激活，进而预防和治疗肺部炎症疾病[13]。黄芩素可通过调节辅助性T细胞1（Th1）/辅助性T细胞2（Th2）细胞因子失衡和肥大细胞释放组胺来治疗过敏性哮喘[14]。白藜芦醇可减轻哮喘导致的气道炎症和气道重塑[15]，可调控过敏性哮喘小鼠热休克因子1（heatshockfactor1，HSF1）与腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的表达，进而降低哮喘引发的炎性反应及气道高阻力，减轻肺组织损伤[16,17]，白藜芦醇能够减少哮喘发作产生的气道黏液，减轻发作症状[18]。

通过网络分析和分子对接研究表明，射干麻黄汤的药效物质中的22个关键活性成分是通过Ptgs2、Adora1、Pparg和Akt1等靶点发挥治疗哮喘的作用。在哮喘气道中，Adora1等受体与腺苷相互作用发挥抗炎作用[19]。在哮喘患者中，Pparg基因表达与气道炎症和重塑反应有关，激活Pparg可下调Th2型细胞因子的产生和嗜酸性粒细胞功能，减少过敏性哮喘中的肺部炎症和-干扰素（interferon-,IFN-）、IL-4和IL-2的产生[20]。Akt1是PI3K-Akt信号通路中的重要分子，PI3K-Akt信号通路是介导肥大细胞炎症介质和细胞因子分泌的主要通路，在哮喘炎症的发生和发展中起重要作用[21]。

综上所述，通过网络药理学和分子模拟初步确定了射干麻黄汤中22个关键活性成分主要作用于15个靶点通过多条途径治疗哮喘，揭示了射干麻黄汤通过“多成分、多靶点和多途径”治疗哮喘的物质基础和作用机制，为射干麻黄汤的进一步开发利用提供了理论基础和科学依据。