一种超低温冷冻蜜蜂精液方法的研究

庄明亮，李剑飞，李志勇，葛蓬，王志

（吉林省养蜂科学研究所，吉林吉林132108）

关键字：蜜蜂；精液；超低温冷冻

蜜蜂是一种重要的经济昆虫，同时，蜜蜂也是一种重要的生态昆虫，其为农作物授粉产生很高的生态价值。随着生态的破坏和农药大面积的使用等因素，蜜蜂种质资源遭到破坏，保护蜜蜂种质资源越来越引起人们的重视。

蜜蜂种质资源保护通常采用群体水平上的活体保种技术，但活体保存风险性较高，受气候、蜜粉源及病敌害等外界因素影响较大[1]。蜜蜂精子冷冻技术能够将优质蜂种的精子低温下长时间冷冻保存，最大程度减少外界因素的影响，提高蜜蜂种质资源保护的可靠性[2,3]。因此，目前蜜蜂珍稀种质资源的保护除了采用群体水平上的活体保种技术以外，还采用细胞水平上的精子低温冻存技术。蜜蜂精子冷冻技术的出现，丰富了国家级蜜蜂基因库保种技术手段，为珍稀蜜蜂种质资源保护提供技术支撑，为蜜蜂遗传育种以及蜜蜂生物学科发展做出贡献。

精子冷冻保存从1803年问世以来，1964年Sawada和Chang首次利用7%的甘油作为冷冻保护剂成功的将蜜蜂精子保存，拉开了蜜蜂精子冷冻保存的序幕[4-6]。近几年蜜蜂精液低温冷冻保存技术取得了一些进步，2010年Hopkins和Herr利用10%二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）作为冷冻保护剂，缓慢降温至冰点以上平衡，解冻后蜜蜂精子活率达到93%[7]。2014年Wegener等[8]开发高渗透冷冻保护剂，然后用解冻后的精液进行人工授精，蜂王的产子区占整个子脾的47.5%。关于蜜蜂精液冷冻的研究更多集中在冷冻保护剂的筛选和冷冻方法优化，本文从降低冷冻保护剂对蜜蜂精液的毒害作用入手，采用两步平衡法将冷冻稀释剂和保护剂分别平衡、利用程序降温和离心处理的冷冻方法，考察冷冻后精液的活率、活力和授精蜂王存活率等指标，评价蜜蜂精液冷冻保存效果，为蜜蜂种质资源保存提供一定指导。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验蜂群为吉林省养蜂科学研究所饲养的意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）。

1.2 主要试剂

二甲基亚砜、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾和大豆卵磷脂等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要仪器

纯水设备（型号为RODI），购自上海积聚仪器有限公司；电子天平（型号为JD300-3-G），购自沈阳龙腾电子有限公司；恒温水浴锅（型号DK-8D），购自太仓精宏仪器设备有限公司；冷冻降温仪（型号CL-8000），购自澳大利亚CryoLogic Pty.Ltd.公司。

1.4 方法

1.4.1 蜜蜂精子稀释剂和冷冻保护剂的制备 精子稀释剂制备：用电子分析天平准确称柠檬酸钠（2.430g）、碳酸氢钠（0.210 g）、氯化钾（0.040 g），溶解于40 mL超纯水中，充分搅拌，配置成50mL精子稀释剂，110℃高压灭菌，冷却，放入4℃冰箱中临时存放。

精子冷冻保护剂制备：大豆卵磷脂（1%）、二甲基亚砜（10%），将其溶解于40 mL超纯水中，充分搅拌均匀后，配制成50 mL基础液，110℃高压灭菌，冷却，加入过氧化酶（400L）放入4℃冰箱中临时存放。

1.4.2 蜜蜂精液的获取 在晴朗的午后13～15时，在蜂箱巢门前捕捉排便回巢的健壮、活跃的性成熟雄蜂，用拇指和食指从腹面捉住胸部两侧，拇指按压雄蜂的腹部背板1～3节处，同时向腹部尾端施加压力，强迫“阴茎”外翻并射精。在体视显微镜下，直接用进样器逐只采集雄蜂精液。

雄蜂精液的采集，先将进样器针头吸入少许生理液再吸入一些空气，然后操纵进样器，使针头与精液接触后稍微拉开点距离，但二者并不断开，借助于精液本身的黏滞性，把土黄色精液较完全地抽吸进针头，采集另外1只雄蜂时先向外旋转操纵杆再吸取，保证不出现气泡隔离，待针头内贮满所需精液量后，用生理液封闭针头，以防精液干涸或污染。

1.4.3 蜜蜂精液的冷冻 采集的蜜蜂精液分为试验组与对照组。试验组采用冷冻方法，首先蜜蜂精液与稀释剂按照比例混合摇匀，用湿毛巾包裹后放入4℃冰箱，静置1 h；1 h后取出混合液，再加入冷冻保护剂混合轻轻摇匀，用湿毛巾包裹后放入4℃冰箱静置1 h；把混合稀释剂与冷冻保护剂的蜜蜂精子放入程序降温仪中，设定降温程序以3.5℃/min下降速率从4℃下降到-60℃，然后投入到液氮中保存。

对照组采用传统冷冻方法：精液与稀释剂和冷冻保护剂直接混合轻轻摇匀，用湿毛巾包裹后放入4℃冰箱，静置2 h；将保存容器放置在离液氮液上方2～3 cm处快速降温，最后投入液氮中冷冻保存。

1.4.4 蜜蜂精液的解冻 将待解冻的装有蜜蜂精子的容器从液氮取出，放入37℃水浴锅中20 s，期间搅拌加速蜜蜂精子的解冻。试验组蜜蜂精液解冻后，转移至离心管，放入离心机以3 000 r/min离心2 min，弃上清液，加入稀释液混匀后，再进行3 000 r/min离心1 min，再弃上清液，加入稀释液混匀后用于蜜蜂人工授精。对照组蜜蜂精液解冻后直接用于蜜蜂人工授精。

1.4.5 精子活率的测定 按照试验组和对照组的方法分别冷冻保存蜜蜂精液1 d、7d、30d、180 d和360 d，然后解冻用稀释液稀释20倍，取10L精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400显微镜下评价精子活率（直线运动精子百分率）。每次至少检测200个精子，重复10次。

1.4.6 精子活力的测定 按照试验组和对照组的方法分别冷冻保存蜜蜂精液1 d、7 d、30 d、180 d和360 d，然后解冻用稀释液稀释20倍，取10L精液于载玻片上，盖上盖玻片，在400显微镜下评价精子活力。依据如下分级标准进行评价：4级表明精子活力与鲜活精子活力无差别，呈快速圆圈运动；3级表明精子活力极好，精子向前运动为快速原地震动；2级精子活力一般，原地震动或圆圈运动向前曲线运动；1级精子活力差，只在原地蠕动；0级精子不能活动[9]。

1.4.7 处女蜂王存活率的测定分别按照试验组和对照组的方法冷冻保存60 d、180 d以及360 d，然后解冻蜜蜂精子，对30只处女蜂王进行人工授精，吉林省养蜂科学研究所育种场培育的处女蜂王，观察并记录处女蜂王3 d内的存活情况。

1.5 统计学分析

蜜蜂存活试验数据采用SPSS 18.0进行统计分析，采用t检验进行差异显著性分析，数据结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 蜜蜂精子的活率

采用不同方法冷冻保存蜜蜂精子1 d、7 d、60 d、180 d和360 d的精子活率见图1。保存1 d和7 d，对照组和试验组的蜜蜂精子活率差异不显著（P＞0.05）；保存60 d、180 d和360 d，试验组蜜蜂精子活率均显著高于对照组（P＜0.05），说明采用试验组的方法冷冻蜜蜂精液更适合蜜蜂精液的长时间保存，能够保持较高的活率。

图1 不同冷冻方法精子活率的对比Fig.1 The comparison of the sperm motility rate of different freezing methods

2.2 蜜蜂精子的活力

采用不同方法冷冻保存蜜蜂精子，解冻后在400倍显微镜下观察精子活力，结果见图2。保存1d和7d，对照组和试验组的蜜蜂精子活力差异均不显著（P＞0.05）；保存60 d、180 d和360 d，试验组蜜蜂精子活力均显著高于对照组（P＜0.05），说明采用试验组的方法冷冻蜜蜂精液更适合蜜蜂精液的长时间保存，能够保持较高的活力。

图2 不同冷冻方法精液活力的对比Fig.2 The comparison of the sperm vitality of different freezing methods

2.3 人工授精蜂王的存活情况

将对照组和试验组冷冻保存60 d、180 d和360 d的精子，解冻后对处女蜂王进行人工授精，处女蜂王的存活情况见图3。试验组处女蜂王的存活率均显著高于对照组处女蜂王（P＜0.05）。

图3 不同冷冻方法精子人工授精蜂王存活情况Fig.3 The survival of queen bees after artificial insemination with different frozen sperms

3 讨论

精液冷冻过程中会受到一定程度的损伤，主要包括冷冻的冰晶化损伤和保护剂的毒害损伤[10-12]。本试验从减小保护剂对精子毒害损伤入手，通过改进蜜蜂精子、稀释液和冷冻保护剂的静置随即采用两步平衡法，提升了冷冻后蜜蜂精子的活力和活率。说明本试验所用蜜蜂精液稀释液具有保护精子的作用，采用两步平衡法进行精液冷冻，稀释剂先与蜜蜂精液平衡混合，起到保护精子且减小保护剂毒害的作用，所以试验组蜜蜂精液的活力和活率均显著高于对照组的传统方法（P＜0.05）。

本研究结果表明试验组人工授精的处女蜂王存活率显著高于对照组（P＜0.05），因为试验组蜜蜂精液人工授精前经过两步的离心处理，去除保护剂等有害成分，所以试验组人工授精的蜂王存活率显著高于对照组。

本研究优化了蜜蜂精液的冷冻方法，采用两步平衡和程序降温方法低温冷冻蜜蜂精液，冷冻保存60 d、180 d和360 d后的蜜蜂精液活率与活力均比传统冷冻方法显著提高，而且人工授精后处女王的存活率也显著提高，提升冷冻效果，可同时满足蜜蜂精液长期和短期冻存的需求。本研究开发的超低温冷冻蜜蜂精液的方法可有效保证蜜蜂优良蜂种遗传物质的高效传递，实现既经济又安全的运输方式，同时不受检疫的限制，且可降低传播病毒病等的危害，使得低成本利用优良蜜蜂资源成为可能。