人参黄芪片缓解小鼠体力疲劳作用及安全性评价

任多多，孙印石，李珊珊※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118）

现代社会生活和工作压力大，社会发展节奏变快，体力疲劳成为都市人群中非常普遍的现象。当体力疲劳持续时间长时，容易引发注意力不集中、睡眠障碍、肌痛、恶心、头痛和抑郁等神经精神系统症状，影响人们的正常工作、学习和生活[1]，严重时还会导致激素紊乱、免疫失调，甚至器质性疾病等。全球约30%的人口有体力疲劳状况，是非常常见的公共健康问题[2]。临床上常用于治疗体力疲劳的化学药物多为大脑皮层兴奋药，副作用较大[3]。中医药调理疲劳状态多以补气血为主，具有副作用小、功效持久等特点[4]。

人参是我国传统中药材，也是最具有长白山特色的植物资源，《本草纲目》将其列为上品。人参中含有丰富的化学成分[5,6]，具有广泛的生物活性[7,8]，功效温和，是人们预防、治疗疾病和滋补健身的佳品。我国卫生部于2012年9月发出公告（2012年第17号），批准人工种植的人参为新资源食品。目前，国内外学者已经从细胞、动物模型及人体等多个层面证实了人参的抗疲劳作用[9-11]。黄芪是豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓和生肌等功效[12]。研究表明，黄芪含有多种氨基酸、皂甙、糖类化合物以及叶酸、硒、锌和铜等[12,13]，具有免疫调节、延缓衰老和抗菌等作用[14]。人参和黄芪均具有补气作用，人参具有大补元气、益气生津及回阳救逆的功效；而黄芪则具有益气补虚之功效。二者可相辅相成，共同达到保护机体健康目的。人参黄芪片正是以人参和黄芪提取物为主要成分，辅以其他中药材开发研制而成。

因此，本研究以人参黄芪片为研究对象，参照《保健食品检验与评价技术规范》中对于功能学试验的要求，评价人参黄芪片的缓解体力疲劳功效及安全性。

1 材料和方法

1.1 样品

人参黄芪片由中国农业科学院特产研究所特种动植物加工团队提供，人口服推荐剂量为2.0 g/d，成人按60 kg体重计算，折合剂量为0.033 3 g/kg bw。

1.2 主要仪器、器材与试剂

电子天平、722S分光光度计、水浴箱、游泳箱、振荡器、AU680贝克曼库尔特全自动生化分析仪、EKF Lactate scout血乳酸分析仪、冷冻离心机。尿素试剂盒、肝糖原试剂盒，购自南京建成研究所。

1.3 缓解体力疲劳试验方法

1.3.1 试验动物分组选取160只体重18～22 g的雄性ICR小鼠，分为I、II、III和IV组，每组40只，分别用于负重游泳实验、血清尿素、血乳酸和肝糖原测定。随机分为对照、低、中、高剂量人参黄芪片小组，每组10只。根据人体口服推荐量的折合剂量，人参黄芪片低、中、高剂量分别设为人体推荐剂量的5倍、10倍和30倍，即0.167g/kg bw、0.333g/kg bw和1.000g/kg bw，灌胃给药30 d，每天1次。对照组给予等体积的蒸馏水。低、中、高组人参黄芪片灌胃样品配置质量浓度分别为16.7mg/mL、33.3 mg/mL和100 mg/mL，每只小鼠根据体重进行灌胃。实验动物由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2016-0002，饲养环境为室内温度22～25℃，湿度46%～50%。

1.3.2 负重游泳试验于末次给药30 min后，小鼠尾部负荷5%体重的铅皮，置于游泳箱中游泳（水深30 cm，水温25℃），记录小鼠自游泳开始至死亡的时间作为负重游泳时间[15,16]（s）。

1.3.3 血清尿素测定于末次给药30 min后，置于30℃的水中正常游泳90 min，休息1 h后进行眼球取血[17]。于4℃下1 500 r/min离心20 min，收集血清。利用全自动生化分析仪测定血清尿素含量。

1.3.4 肝糖原测定采用蒽酮法，于末次给药30 min后，处死小鼠，取肝脏0.1 g，按试剂盒说明书测定肝糖原含量[15,17]。

1.3.5 血乳酸测定 于末次给药30 min后，内眦静脉丛采血20L，再将小鼠置于30℃的水中游泳10 min，分别在运动后0 min和20 min于内眦静脉丛采血20L，按试剂盒说明书测定血乳酸含量，计算血乳酸曲线下面积[15,18]。血乳酸曲线下面积=1/2（游泳前血乳酸值+游泳后0 min的血乳酸值）10+1/2（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）20[18]。

1.4 小鼠急性毒性试验

取20只体重为18～22 g的昆明小鼠，雌雄各半，每间隔4 h灌胃2次，灌胃体积0.2 mL/10 g bw，累积剂量20 g/kg bw。灌胃前禁食16 h，灌胃后连续观察2周，记录中毒及死亡情况[19,20]。

1.5 Ames试验

采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100和TA102四株菌株进行试验[19,21-23]。采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝微粒体酶（S9）作为体外代谢活化系统。试验设5 000g/皿、1 000g/皿、200g/皿、40g/皿、8g/皿5个剂量。同时设溶剂对照、自发回变和阳性突变剂对照。称样品1.25 g，加入蒸馏水定容至25 mL，其浓度为50 mg/mL，以此液为原液，配成10 mg/mL、2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.08 mg/mL浓度组，高压蒸汽灭菌后备用。试验时，在顶层琼脂中加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试物溶液和0.5 mL S9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上，于37℃培养48 h，计数每皿菌落数。如果受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍以上并有剂量-反应关系者则定为阳性[23]。试验时，计数每皿菌落数，重复两次。

1.6 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

根据文献[19,21-24]中的方法，取50只体重为25～30 g的昆明小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，蒸馏水为阴性对照，环磷酰胺为阳性对照，试验组高、中、低剂量分别为10 g/kg bw、5 g/kg bw、2.5g/kg bw，末次给药后解剖，取胸骨骨髓，涂片，固定，Giemsa染色。显微镜下计数并计算[24]。

1.7 小鼠精子畸形试验

根据文献[23,24]中的方法，取25只体重25～35 g的雄性昆明小鼠，随机分为5组，每组5只，蒸馏水为阴性对照，环磷酰胺为阳性对照，试验组高、中、低剂量分别为10 g/kg bw、5 g/kg bw、2.5 g/kg bw，末次给药后第30天解剖，取副睾涂片，伊红染色，计算畸变精子发生率[24]。

1.8 统计分析

用SPSS 24.0软件进行统计分析。P＜0.05时认为数据间有显著差异。

1.9 结果判定

血清尿素、肝糖原和血乳酸三项指标中任二项阳性，且负重游泳试验结果阳性，可判定人参黄芪片具有缓解体力疲劳功效[15,18]。急性毒性试验中产品对动物无明显中毒情况，对脏器指标无影响，可视为无毒级。

2 结果与讨论

2.1 人参黄芪片对小鼠体重的影响

体重是反映小鼠身体机能的最直观的数据。本研究中，共有4组小鼠被用于进行不同指标的检测。表1～表4记录了各组小鼠的各阶段体重及体重增重情况。统计分析结果表明，与对照组相比，各组小鼠实验不同阶段的体重及增重情况均无显著差异（P＞0.05），说明人参黄芪片对于小鼠的体重无显著影响，符合缓解体力疲劳功能实验对动物的要求。

表1 人参黄芪片对小鼠体重的影响（Ⅰ组：负重游泳）Table 1 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group I:load swimming)

表2 人参黄芪片对小鼠体重的影响（Ⅱ组：血清尿素测定）Table 2 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group II:serum urea test)

表4 人参黄芪片对小鼠体重的影响（Ⅳ组：肝糖原含量测定）Table 4 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group IV:Hepatic glycongen content)

表3 人参黄芪片对小鼠体重的影响（Ⅲ组：血乳酸测定）Table 3 Effects of Renshenhuangqi tablets on the body weight of mice(Group III:Blood lactic acid content)

2.2 人参黄芪片对小鼠负重游泳时间的影响

负重游泳时间是疲劳小鼠模型中常用于衡量运动耐力的指标，也是小鼠肌肉运动能力的直观参数，负重游泳时间越长，小鼠抗运动疲劳的能力越强[25]。因此，该时间的长短可以反映小鼠抵抗疲劳能力的强弱。与对照组相比（表5），人参黄芪片高剂量组小鼠负重游泳时间显著延长（P＜0.05），而低剂量组和中剂量组则无显著影响（P＞0.05）。

表5 人参黄芪片对小鼠负重游泳时间的影响Table 5 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the weight-loaded swimming time in mice

2.3 人参黄芪片对小鼠血清尿素的影响

血清尿素与小鼠的疲劳程度、运动适应性以及负荷量密切相关，是评定疲劳程度的常用指标[26]。通常，当运动负荷增加时，血清尿素含量也相应增加。血清尿素水平越高，则表明机体对运动负荷的适应能力越差，小鼠越疲劳；反之，血清尿素水平越低，机体对运动负荷的适应能力越强，小鼠抗疲劳的能力也越强。与对照组相比，给予人参黄芪片低剂量和中剂量时，能够降低小鼠的血清尿素水平（表6），但差异不显著（P＞0.05）；高剂量组可显著降低小鼠血清尿素水平（P＜0.05），具有一定的抗疲劳作用。

表6 人参黄芪片对疲劳小鼠血清尿素的影响Table 6 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the serum urea in mice

2.4 人参黄芪片对运动后小鼠血乳酸变化的影响

运动过程中，糖酵解产生的乳酸容易在肌肉组织中累积。降低血乳酸的累积，能够有效缓解疲劳的发生，提高机体抗疲劳的能力[25]。人参黄芪片各剂量组小鼠的血乳酸曲线下面积与对照组比较（表7）差异均不显著（P＞0.05），提示人参黄芪片可能通过其他途径达到抗体力疲劳的效果。

表7 人参黄芪片对小鼠血乳酸变化的影响Table 7 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the blood lactic acid in mice

2.5 人参黄芪片对小鼠肝糖原储备量的影响

肝糖原是哺乳动物体内非常重要的能量物质，其储备量对机体的运动能力以及疲劳出现的速度和程度都有重要的影响[27]。肝糖原储备量增加，有助于提高小鼠的运动能力和耐力，进而达到抗疲劳的效果[27]。与对照组相比，人参黄芪片低剂量组和中剂量组能够增加肝组织中肝糖原的含量（表8），但无统计学意义（P＞0.05）；高剂量组小鼠的肝糖原储备量明显高于对照组，且差异显著（P＜0.05）。

表8 人参黄芪片对小鼠肝糖原储备量的影响Table 8 Effects of Renshenhuangqi Tablets on liver glycogen reserve in mice

2.6 急性经口毒性试验

由表9可见，以20 g/kg bw剂量的人参黄芪片灌胃给雌雄昆明小鼠后，无明显中毒症状，观察14 d无死亡[19,22]。观察期末解剖小鼠，未见心、肝、脾、肺、肾和肠胃等主要脏器组织明显异常[22]。人参黄芪片对小鼠的最大耐受剂量大于20 g/kg bw，根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中的急性毒性分级标准，属无毒级。

表9 急性经口毒性试验小鼠体重及死亡数情况Table 9 Weight and death amounts of mice during acute oral toxicity test

2.7 Ames试验

阳性对照[28]：TA97a+S9、TA98+S9和TA100+S9采用2-AF（剂量：10.0g/皿）；TA97a-S9和TA98-S9采用9-芴酮（剂量：0.2g/皿）；TA100-S9采用NaN3（剂量：1.5g/皿）；TA102+S9采用1,8-二羟蒽醌（剂量：50.0g/皿）；TA102-S9采用MMC（剂量：0.5g/皿）。表10和表11同。

表10 人参黄芪片Ames试验结果（第1次）（±s）Table 10 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(first times)(±s)

表10 人参黄芪片Ames试验结果（第1次）（±s）Table 10 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(first times)(±s)

受试物Subject剂量（g/皿）Dose TA97a TA98 TA100 TA102+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9受试物5 000 116.0±11.4 121.0±10.4 33.7±6.4 33.0±4.4 137.3±11.1 159.3±18.1 286.3±11.7 267.7±15.1 1 000 121.7±13.7 115.3±10.1 37.7±3.1 32.3±4.0 164.0±14.5 141.7±21.1 287.3±10.7 270.0±22.3 120.0±12.1 115.7±14.0 40.7±5.0 34.3±5.8 152.7±21.5 158.3±14.7 276.3±11.9 266.0±14.9 200 40 117.0±11.5 118.7±11.4 39.3±6.1 35.3±6.1 137.7±15.0 149.3±17.5 288.0±23.3 269.0±18.5 8 119.3±12.9 118.3±10.4 35.0±4.0 35.7±5.1 144.0±13.1 150.3±21.1 279.0±16.5 269.3±17.1自发回变 116.7±11.2 112.7±11.6 38.3±5.5 34.7±6.4 146.3±15.9 144.3±13.9 281.3±23.3 279.3±21.6溶剂对照 117.7±10.5 115.0±11.1 39.7±6.4 33.3±3.1 145.7±20.1 150.7±22.5 272.3±18.0 265.0±23.0阳性对照 1 302.0±128.3 1 292.3±101.5 2 527.0±165.3 2 266.7±133.3 2 559.7±167.9 2 427.3±115.7 1 046.0±162.8 2 257.3±137.0

表11 人参黄芪片Ames试验结果（第2次）（±s）Table 11 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(second times)(±s)

表11 人参黄芪片Ames试验结果（第2次）（±s）Table 11 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the Ames test result(second times)(±s)

受试物Subject剂量（g/皿）Dose TA97a TA98 TA100 TA102+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9受试物5 000 115.0±10.8 116.7±10.6 38.0±5.3 36.3±4.0 146.3±17.2 165.7±11.7 277.3±11.7 272.0±11.5 1 000 113.0±18.7 114.0±14.8 34.7±4.2 34.3±3.8 147.0±10.8 140.3±10.1 283.3±16.2 270.3±23.7 200 117.0±12.5 110.3±14.5 37.3±3.2 37.0±4.4 156.7±11.7 150.0±13.7 289.0±21.2 262.7±11.9 40 121.0±19.3 119.7±14.2 38.7±3.1 36.7±3.1 145.7±12.5 172.0±13.5 280.0±12.8 275.3±13.8 8 116.0±11.4 118.0±13.0 35.3±5.5 36.0±6.0 142.3±15.0 144.7±17.2 290.7±10.2 272.7±25.9自发回变 112.0±12.8 116.3±19.0 39.3±5.9 35.0±5.0 153.7±14.3 132.7±11.9 282.7±11.2 267.0±19.3溶剂对照 119.3±14.6 107.7±16.9 40.0±3.0 35.7±4.5 137.0±11.1 147.3±18.1 285.3±14.4 264.7±13.1阳性对照 1 289.7±129.4 1 208.3±143.6 2 515.0±133.5 2 237.0±110.5 2 486.3±125.8 2 410.3±165.8 1 070.7±145.5 2 295.7±146.9

由表10及表11可见，对4株试验菌株，加与不加S9，人参黄芪片各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，亦无剂量反应关系。

2.8 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

续表

由表12可见，人参黄芪片各剂量组微核率与阴性对照组比较无显著性差异（P＞0.05），而环磷酰胺组与阴性对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。人参黄芪片各剂量组PCE/NCE比值未少于阴性对照组的20%，表明人参黄芪片对小鼠骨髓细胞未见明显毒性。2.9小鼠精子畸形试验

表12 人参黄芪片对小鼠骨髓微核发生率的影响Table 12 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the incidence of micronucleus in bone marrow of mice

由表13可见，人参黄芪片各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较无显著性差异（P＞0.05），而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。

表13 人参黄芪片对小鼠精子畸形发生率的影响Table 13 Effects of Renshenhuangqi Tablets on the incidence of sperm abnormalities in mice

疲劳是一种主观不适感觉，疲劳发生后如果得不到及时恢复，会使机体发生激素紊乱、免疫力下降或器质性疾病，威胁人类健康[29]。中医早在两千多年前就已开始记载和研究“疲劳”这一现象。许多中草药可用于治疗和缓解疲劳，如人参、黄芪、黄精、西洋参、党参、何首乌、葛根、山药、山楂、沙棘、桑葚、麦冬、枸杞子、红景天、百合、银杏叶、肉苁蓉、鹿茸、淫羊藿、巴戟天、鹿角盘、五味子、刺五加和灵芝等[30-36]。中草药在缓解疲劳方面具有一定的优势，如安全性高，效果明显，毒副作用小，可通过多靶点多方面缓解疲劳症状，而现有的保健食品中，以西洋参和枸杞的使用频率最高[31]。现代医学研究表明，人参和黄芪中的人参皂苷、人参多糖、黄芪甲苷和黄芪多糖等成分均具有一定的抗疲劳作用[31,37]。人参作为我国传统中药材，自古被誉为“百草之王”，在《本草纲目》中就有记载，具有“大补元气，复脉固脱”的功效。人参黄芪片就是以人参、黄芪、淫羊藿和巴戟天为主要原料开发而成的一款具有缓解体力疲劳的保健食品。按照《保健食品检验与评价技术规范》中的规定与要求，证实了该人参黄芪片的缓解体力疲劳功效和安全性，但还有许多工作需要补充和完善，如产品的生理生化指标检测、卫生学检验等等，这些都将在今后的工作中逐步进行。总之，虽然人参、黄芪、淫羊藿、巴戟天或其他中草药对于缓解体力疲劳的机制还有待进一步研究，但我们的研究结果可以为类似研究提供一些数据和理论参考。

3 结论

根据人参黄芪片人体口服推荐量（0.0333g/kg bw）的折合剂量，该产品在小鼠实验中的给药低、中、高剂量分别设为人体推荐剂量的5倍、10倍和30倍，即0.167 g/kg bw、0.333 g/kg bw和1.000 g/kg bw。经口给予小鼠人参黄芪片30 d后，小鼠的负重游泳时间显著延长，肝糖原储备量显著增加，运动后血清尿素水平显著降低；急性毒性试验中产品使用无明显动物中毒情况，对脏器指标无影响，3项遗传毒性试验结果均为阴性。参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版），该产品具有缓解体力疲劳的功效，且属于无毒级。