乳酸菌发酵生产D-/L-乳酸的研究进展

刘金熙，李冠洋，金 清

（延边大学 农学院，吉林延吉 133002)

乳酸，学名α-羟基丙酸或2-羟基丙酸，是自然界中最小的手性分子。由于乳酸分子内含有一个不对称的碳原子，因此按其旋光性可分为D（-）-乳酸，L（+）-乳酸。合成L-乳酸的乳酸菌大致分布在乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属和片球菌属中的40余种[1-2]。合成光学纯D-乳酸的乳酸菌主要分布在乳杆菌属[1,3]、芽孢杆菌属、明串珠菌属和芽孢乳杆菌属4个属[4-5]。乳酸是世界三大有机酸之一，被美国食品和药品管理局认定为“公认安全物质”，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域[6]。乳酸制备方法中，与化学合成法相比，微生物发酵法生产得到的乳酸因纯度更高而备受青睐。具备优良发酵特性的菌种是微生物发酵法工业化的核心。本文对基因工程发酵生产D-/L-乳酸优良菌种的研究进展进行综述。

1 乳酸的制备方法

目前，应用于工业化生产乳酸的方法主要有两种，分别是化学合成法和微生物发酵法[7-8]。化学合成方法制备乳酸有乳腈法、丙烯腈法、丙酸法、丙烯法等。通过化学合成法生成的乳酸一般需要进行化学手段拆分，实现难度大、成本高，且过程中产生的毒性对人与环境均造成较大威胁，因此一些地区禁止应用此类方法进行乳酸的工业合成[9-10]。微生物发酵法是在以葡萄糖、蔗糖、淀粉等糖类作为发酵碳源的培养基中接入微生物，如乳酸菌等发酵生产乳酸的方式进行生产[11]。根据发酵途径不同，一般分为同型乳酸发酵、异形乳酸发酵和双歧发酵。与化学合成法相比，微生物发酵法生产得到的乳酸纯度较高，生产出来的聚乳酸的商业价值也更高，从而被广泛应用。

2 优良菌种筛选与改造

优良菌种是发酵产业的的核心，也是乳酸工业化生产保障。自然筛选作为一种菌种选育的手段，对工业中微生物育种有很大的作用。吴锦兰等[12]以柳州传统发酵酸笋为原料，分离并筛选得到一株高产乳酸的乳酸菌菌株LB-1-23，并鉴定其为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。在优化条件下，乳酸产量为12.74 g/L。宫路路等[13]从云南传统发酵豆豉中分离并筛选得到一株高产乳酸的植物乳杆菌，并对其产酸培养基组成及条件进行优化，将之命名为Lactobacillus plantarumYM-4-3。吴锦兰等、宫路路等均通过自然选育的手段筛选得到高产乳酸的植物乳杆菌，但该方法的缺点是菌株自然突变的概率较小，比较难筛选得到理想的菌株。通过传统的物理、化学的方法进行诱变得到所需菌株的方法也比较常见，王云晓[14]、刘联杰[15]均对出发菌株进行紫外诱变与硫酸二乙酯（DES）诱变，得到生成相应手性乳酸的目标菌株。虽然所得菌株突变率高，但需要对突变菌株进行遗传稳定性试验，工作量繁重。目前，分子生物学技术在乳酸合成领域的应用受到广泛关注。通过利用基因工程技术的方法育种可以克服上述两种方法的缺点，对菌株进行定向改造并稳定遗传，所得菌株可以进行高纯度的D-乳酸或L-乳酸合成。

乳酸脱氢酶（Lactate Hehydrogenase，LDH）是乳酸菌生成乳酸代谢途径中催化丙酮酸转化成乳酸的关键酶，其立体定向性决定了乳酸的构型。根据催化产物不同，乳酸脱氢酶分为D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶两种，分别产生D-乳酸和L-乳酸[16-17]。乳酸的合成构型由D,L-乳酸脱氢酶基因的表达水平决定，所以当下国内外的研究重点主要集中在乳酸菌的D,L-乳酸脱氢酶的编码基因上[18]。

KONG等[19]通过基因修饰并敲除推测的D-乳酸脱氢酶基因构建了高效产L-乳酸的马仙克鲁维酵母菌株。经同步糖化、共同发酵，该菌株在42 ℃下从玉米芯渣中产L-乳酸103.00 g/L，光学纯度99.5%。OKINO等[20]利用基因工程手段敲除谷氨酸棒杆菌L-乳酸脱氢酶基因，再转入大肠埃希菌D-乳酸脱氢酶基因，所得菌株发酵生产D-乳酸的量达到120 g/L，光学纯度高于99.9%。张媛等[21]对筛选得到的一株耐高温耐高糖的植物乳杆菌使用同源重组的基因工程手段，进一步提高其活性，得到基因工程菌Lp-DA。该菌株45 ℃发酵产乳酸近200 g/L，D-乳酸光学纯度达到99.9%。生长迅速，营养需求简单，发酵周期短的大肠杆菌在代谢工程育种中，具有遗传背景清楚、易于进行遗传操作等显著优势[22]。赵锦芳等[23]构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌，在15 L发酵罐中以6%的葡萄糖为碳源进行发酵，乳酸生产强度为1.14 g/（L·h），乳酸的产量达到41.13 g/L。L-乳酸纯度达95.69%。TIAN[24]通过CRISPR-Cas9基因编辑平台开发了一株高光纯度L-乳酸生产菌株。利用自适应进化技术，选育出在高温45 ℃下能高效产L-乳酸的高效菌株NCBIO01-M2-ldhL1-HT。该菌株在高初始葡萄糖浓度下进行开放发酵，可产生221.0 g/L的L-乳酸。发酵液中L-乳酸光学纯度达99.1%以上，L-乳酸产率达7.5 g/L/h以上，产率达0.96 g/g以上。鲁泓鹰[25]采用RED基因置换技术将ldh L基因置换为ldh A基因，对产D-乳酸的大肠杆菌工程菌株进一步厌氧生长筛选，得到一株厌氧条件生长良好的菌株LHY02。在单因素实验的基础上，在最优发酵条件下发酵，得到D-乳酸产量为（38.18±1.85）g/L。周丽[26]在关于基因删除对大肠杆菌乳酸代谢影响进行了系统地研究，将野生型大肠杆菌中的8个基因进行了选择性地组合删除，得到重组菌株B0013-070，D-乳酸产量可达125 g/L，光学纯度大于99.9%。

3 结语

菌种性能优劣直接关系到发酵工业的成败，野生型菌株一般要进行育种后才能达到工业要求进行发酵生产。随着D-/L-乳酸在生活中的需求日益扩大，以单一酶促反应为出发点的菌种改造应用在工业生产仍有局限。未来应以酶促反应之间的协同作用为突破点，充分利用现有的研究资料与现代科学，开展对D-/L-乳酸发酵生产菌的代谢网络分析和育种，从而进一步契合工业生产的要求。