7种大孔吸附树脂用于苦参碱分离性质研究

任莉莉，杨凌鉴，彭勇，陈紫成，金华峰，徐世明

（1.安康学院化学化工学院，陕西安康725000；2.安康学院秦巴中药资源研发中心，陕西安康725000；3.北京大学安康药物研究院，陕西安康725000；4.北医大院士工作站，陕西安康725000）

苦参（Sophorae flavescens Radix）为豆科植物苦参的干燥根，性寒，味苦，归心、肝、胃、大肠及膀胱经，具有清热燥湿、杀虫、抗菌和利尿的功效。苦参含大量生物碱，其中苦参碱和氧化苦参碱约占苦参总生物碱的70%，除此之外，苦参中还含有其他各类生物碱，如槐果碱、槐定碱等[1-3]。苦参碱（matrine）纯品为柱状或针状结晶，易溶于水、甲醇、乙醇、苯、氯仿及乙醚等有机溶剂，微溶于石油醚。苦参碱具有很多药理活性，包括抗肿瘤、抗肝炎病毒、保肝、调节心血管系统、调节免疫、抗炎、抗菌和杀虫等，已被广泛的应用于临床[2,4,5]。氧化苦参碱（oxymatrine）也常与苦参碱一同存在于苦参药材中[2,4]。根据生产需求，可以将氧化苦参碱和苦参碱互相转化，从而获得更多目标产物[6]。

苦参中生物碱常用提取方法为溶剂提取法，依据相似相溶的原理选用对生物碱溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，常用酸水提取法和乙醇提取法[7,8]。具体操作包括浸提、回流和渗漉等，另外还有超声辅助提取法和微波辅助提取法等。分离纯化方法包括阳离子交换树脂层析、大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、氧化铝柱层析、重结晶和盐析等[9,10]。很多分离纯化方法用到大量有毒试剂，威胁生命安全且污染环境，并且很难高效获得较纯的目标产物[2]。工业生产要求最大程度利用原材料并获得纯度较高的产物，且提取工艺尽可能不使用毒性溶剂。在此，本研究以苦参为原料，在提取过程中，将氧化苦参碱还原为苦参碱，从而获得更多的目标产物苦参碱；同时基于工业生产对苦参提取工艺的要求，选用制药公司常用的7种大孔吸附树脂进行苦参碱的分离研究，优选最佳分离树脂及条件，为工业生产提供支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（LC2000，上海天美科学仪器有限公司）；电子调温加热套（DZTW，天津工兴实验室仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE5286A，上海亚荣生化仪器厂）；恒温水浴锅（B-260，上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（SQP，赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 材料

苦参，由安康北医大制药股份有限公司提供，经徐世明教授鉴定为正品。苦参碱（M109802）、氧化苦参碱（A111286）对照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，98%。无水乙醇，天津天力化学试剂有限公司，分析纯。大孔树脂D101、HPD450、HPD722购自沧州宝恩化工有限公司。大孔树脂LSA20、LSA21、LSA700B、AB8购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。树脂的物理性能指标见表1。

表1 7种大孔吸附树脂基本性能Table 1 The basic properties of seven kinds of macroporous adsorption resins

2 实验方法与结果

2.1 苦参碱含量测定

参考2020版药典苦参药材项下苦参碱含量测定方法，利用高效液相色谱法（HPLC）进行苦参碱的含量测定。对照品溶液制备：精密称定苦参碱，加乙腈-无水乙醇（80:20）制成每mL含苦参碱50g。供试品溶液制备：二氯甲烷提取溶液中的苦参碱后，回收溶剂至干，加无水乙醇定量溶解。氨基键合硅胶柱（4.6 mm 250 mm，5m）；流动相为乙腈-无水乙醇-3%磷酸（80:10:10）；流动相流速1.0 mL/min；检测波长220 nm；柱温25℃。分别精密吸取对照品和供试品各20L进样检测，每组平行检测3次。苦参碱保留时间约8.9 min（图1 A）。

2.2 苦参碱粗提液制备

称取苦参药材200 g，粉碎并过100目筛。将苦参粉末和7倍量60%乙醇混合，回流2.5 h，收集提取液；第2次和第3次回流提取溶剂加入量均为5倍量，回流时间1 h，过滤收集并合并滤液。利用旋转蒸发仪回收乙醇，然后加40% HCl调pH 2～3，加4.4 g亚硫酸氢钠搅拌过夜，将氧化苦参碱转化为苦参碱，静置，过滤，待用。按照“2.1”项下方法测得提取液中苦参碱浓度为302.83g/mL（高效液相色谱图见图1 B）。

图1 对照品（A）和苦参待分离液（B）高效液相色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of the reference substance(A)and the preparation solution of Sophora flavescens(B)

2.3 树脂预处理

分别量取一定量树脂，湿法装柱，2%NaOH淋洗（2 BV），流速为1.5 BV/h左右，然后用蒸馏水以相同流速洗至中性；5% HCl淋洗（2 BV），流速为1.5 BV/h左右，然后用蒸馏水以相同流速洗至中性；95%乙醇淋洗（2 BV），流速为1.5 BV/h左右，然后用蒸馏水以相同流速洗至无醇味[11]。

2.4 静态吸附法初选树脂

分别准确量取7种大孔吸附树脂各5mL于25mL锥形瓶中，加碱性苦参提取液（pH 9）12 mL，摇匀，静态吸附2 h，过滤，收集滤液。按“2.1”项下高效液相色谱法进行含量测定。苦参碱的吸附率=（苦参碱总量－未吸附苦参碱量）/苦参碱总量100%。滤液苦参碱量及苦参碱吸附率结果，见表2。LSA21静态吸附率最大，其次是HPD722和D101。后续选择LSA21、HPD722和D101进行动态吸附及解析实验。

表2 7种大孔吸附树脂吸附苦参碱情况Table 2 Adsorption of matrine by seven macroporous resins

2.5 动态吸附及解析优选树脂

准确量取3种树脂D101、LSA21和HPD722各10 mL，湿法装柱，分别连续添加碱性苦参提取液（pH 9），流速2 BV/h，收集流出液，进行薄层色谱（TLC）定性检测，与苦参碱对照品相同位置出现斑点即为动态吸附终点。薄层色谱方法如下：取苦参碱和氧化苦参碱对照品，分别加无水乙醇制成每1 mL含0.2 mg溶液，作为对照品溶液。吸取收集样品和对照品分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-25%氨水（5:0.5:0.2）为展开剂，展开，晾干，喷碘化铋钾试液。D101、LSA21和HPD722最大吸附苦参提取液体积分别为22mL、32mL和58mL，最大吸附量为提取液体积 苦参碱浓度。其中HPD722动态吸附苦参碱量最大（图2），为17.56 mg/mL±1.82 mg（1.76 mg/mL±0.18 mg/mL树脂）。

图2 3种树脂动态条件下苦参碱最大吸附量Fig.2 The maximum adsorption capacity of matrine of the three resins under dynamic conditions

完成动态吸附后，用3 BV蒸馏水进行冲洗，流速控制在2 BV/h左右，然后用90%乙醇溶液洗脱载样树脂，洗脱体积为5 BV，流速控制在2 BV/h左右。收集洗脱液，通过高效液相色谱法检测其含量，理论解析率为洗脱苦参碱量/苦参碱总量100%。3组树脂苦参碱解析率结果如图3所示。LSA21和HPD722都有较高的解析率，分别为85.35%和86.45%。结合动态最大吸附量实验结果，以选择吸附量大、解析率高的树脂，尽可能充分地分离和回收目标产物为目的，故选择HPD722为最佳树脂进行后续工艺条件的研究。

图3 3种树脂动态解析率Fig.3 Desorption rate of the three resins under dynamic conditions

2.6 最佳树脂分离条件研究

2.6.1 上样速度准确量取HPD722 10 mL共5份，分别装柱并以2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h、6 BV/h进行上样，每组碱性苦参提取液用量为3BV（pH为9），收集流出液；用2BV去离子水进行冲洗，收集流出液，并与之前收集流出液合并。按照“2.1”项下方法进行含量测定。苦参碱吸附率为（苦参碱总量未吸附苦参碱量）/苦参碱总量100%。由图4可以看出，在不同上样速度条件下，HPD722树脂对苦参碱的吸附率均较高，在速度为2 BV/h和3 BV/h时，用高效液相色谱仪几乎检测不到流出液中苦参碱的信号，吸附率接近100%，故选择3 BV/h为最佳上样速度。

图4 不同上样速度时HPD722树脂对苦参碱的吸附率Fig.4 The adsorption rate of matrine by HPD722 resin at different flow rates

2.6.2 上样pH准确量取HPD722 10 mL，共5份，分别装柱，取苦参提取液30 mL共5份，用25%NH3·H2O调pH分别至3、5、7、9和11。以3 BV/h上样，收集流出液；20 mL去离子水冲洗，收集流出液，并与之前流出液合并。按照“2.1”项下方法进行含量测定。苦参碱吸附率计算公式同2.6.1。由图5可以看出，在pH为3时，HPD722树脂对苦参碱几乎没有吸附效果；随着pH增大，吸附率逐渐增大，最大吸附率时（98.47%）上样pH为9；当pH为11时，吸附率有所降低。故选择pH为9时为最佳上样pH。

图5 不同上样pH时HPD722树脂对苦参碱的吸附率Fig.5 The adsorption rate of matrine by HPD722 resin at different loading pH

2.6.3乙醇洗脱浓度和体积准确量取HPD72210mL，装柱，取苦参提取液30mL进行上样（pH 9），20 mL去离子水冲洗。用不同浓度乙醇（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%）进行洗脱。每个浓度洗脱体积为5 BV，流速控制在2 BV/h。收集每个浓度洗脱液，进行薄层色谱定性检测，乙醇在低浓度（＜20%）时无明显产物点，≥30%时有产物点，≥70%时无产物点（图6 A）。说明低浓度乙醇可洗脱除去杂质，高浓度乙醇可洗脱苦参碱。考虑实际生产情况及后续浓缩操作，选用20%乙醇洗脱除杂，70%乙醇洗脱产物。从TLC结果可以看出，乙醇洗脱液中主要产物点为苦参碱，且无明显氧化苦参碱，说明该工艺过程的可行性，进一步可通过结晶获得纯度较高的苦参碱[9]。

另相同条件下装柱、上样，用5 BV 20%乙醇洗脱除杂，再用10 BV 70%乙醇进行洗脱，定量收集流出液（每20 mL一瓶），按照“2.1”项下方法进行含量测定，解析率为洗脱苦参碱量/苦参碱总量100%。由图6 B可以看出，随着洗脱液体积的增加，累计解析率不断增大。大部分苦参碱在乙醇用量为20 mL时就能达到接近90%的解析率，当乙醇用量达到40 mL时，解析率接近100%。所以在此操作条件下，洗脱体积为60 mL，即6 BV时洗脱较为完全。

图6 A：HPD722树脂解析TLC结果。B：不同洗脱溶剂用量时苦参碱的累计解析率Fig.6 A.The dynamic desorption at different concentrations of ethanol.B.The cumulative desorption rate of matrine at different eluent volume.

2.6.4 洗脱速度准确量取HPD722 10 mL 5份，分别装柱并取苦参提取液30 mL进行上样（pH为9），20 mL去离子水冲洗，60 mL 70%乙醇进行洗脱。洗脱速度分别是2BV/h、3 BV/h、4BV/h、5BV/h和6BV/h。收集洗脱液，按照“2.1”项下方法进行含量测定。理论解析率为洗脱苦参碱量/苦参碱总量100%。在各种洗脱流速条件下，苦参碱解析率均较高（图7），均大于85%。在乙醇洗脱速度为2 BV/h和3 BV/h时，解析率分别为96.49%和96.10%。实际操作时，可选择3 BV/h为最佳洗脱流速，既节约时间又能达到较高的解析效果。

图7 不同洗脱速度时苦参碱的解析率Fig.7 The desorption rate of matrine at different elution flow rates

3 讨论

7种大孔树脂静态吸附苦参碱吸附率有明显差别，可能由于苦参碱属于弱碱物质，有一定的亲水性，有利于非极性或弱极性树脂的吸附，并且LSA21具有较大的比表面积，静态吸附量较大[11,12]，其次是HPD722和D101。由于动态吸附和静态吸附过程有所不同，导致在两种情况下被吸附物质量有所差异，最终树脂选择还是以实际生产中使用的动态吸附情况为参考，即选择动态吸附量最大的HPD722为该条件下的最优吸附树脂。

HPD722树脂对苦参碱吸附性能较好。在pH为3时，HPD722树脂对苦参碱几乎没有吸附效果，因为在强酸性条件下苦参碱成盐后更易溶于水并随水流出。随着pH增大，吸附率逐渐增大。当pH为11时，吸附率有所降低，可能是因为苦参碱在强碱性条件下水解开环所致[13]。使用不同浓度乙醇为洗脱溶剂，对环境比较友好，产物收率高。大孔吸附树脂分离纯化苦参提取液中的苦参碱操作简单，树脂容易再生。HPD722树脂可进一步应用于工业放大生产分离纯化苦参碱，并结合萃取、结晶等操作进一步增加产物的纯度。