紫薯花青素大孔吸附树脂的筛选

王世鹏，王 岩，范龙一

（1.黑龙江省标检产品检测有限公司，黑龙江 哈尔滨 150000；2.黑龙江省市场监督管理审核查验中心，黑龙江 哈尔滨 150000）

花青素（Anthocyanidin） 又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，是花色苷水解而得有颜色的苷元[1]。花青素属于生物类黄酮物质，而黄酮物质最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。紫薯（Ipomoea batatas（L.） Lam） 又称紫甘薯，紫薯的活性成分主要包括花青素、糖蛋白、绿原酸、黄酮类、脱氢表雄酮和膳食纤维等[2]，其所含花青素与葡萄皮等原料相当，其稳定性又高于黑莓色素和葡萄皮等，是一种重要的天然色素，在食品行业有着广阔的应用前景[3]。研究表明，紫薯花青素对·OH、H2O2等活性氧均具有清除和抑制作用，尤其对·OH 的清除能力强于抗坏血酸，且清除作用与浓度呈剂量关系[4]，具有抗氧化、清除自由基、抗突变、抗癌症、抗心血管疾病、抗高血糖、改善肝功能等功效。

分离纯化花青素的方法主要包括液相萃取法、柱层析法、固相萃取法、凝胶色谱法凝胶色谱、微生物发酵法、高速逆流色谱法、分子烙印技术等。其中，大孔吸附树脂柱层析法具有吸附量大、效率高、成本低、可再生等优点[5]，目前已发展为从不同类型植物中提纯花青素最为常用的分离纯化方法之一，用于玫瑰茄、树莓、紫甘蓝和蓝莓[6-7]等花青素的提取。孙倩怡[8]采用D3520 型大孔树脂对蓝莓花青素进行分离纯化，显著提高了花青素纯度。薛宏坤等人[9]利用大孔树脂-Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶联用技术从巨峰葡萄皮中获得3种花色苷组分，并且纯度都达到了90%以上。筛选出适于紫薯中花青素的分离纯化的树脂类型，并对其吸附和解析性能进行研究，以期为紫薯在食品、药品等领域的开发利用提供一定的理论依据和数据支持，为工业化生产紫薯花青素提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料和试剂

紫薯，购于当地超市；无水乙醇（试剂纯）、盐酸（试剂纯）、氢氧化钠（试剂纯），西陇科学股份有限公司提供；AB-8 型大孔树脂（非极性）、D101型大孔树脂（非极性）、NKA-9 型大孔树脂（非极性）、NKA-II 型大孔树脂（非极性）、RAS80 型大孔树脂（非极性）、RAS07 型大孔树脂（非极性）、RAW16 型大孔树脂（极性）、RAW01 型大孔树脂（极性）、RAW19(H)型大孔树脂（极性）、RAW92 型大孔树脂（极性），天津南开和成科技有限公司提供。

1.1.2 仪器与设备

SPECORDR 210 PLUS 型紫外可见分光光度计，德国analytikjena 仪器有限公司产品；SD20 型pH计，梅特多- 托乐多（上海） 仪器有限公司产品；BSA224S 型电子天平，德国Sartorius 公司产品；胶体磨，韬越（上海） 机械科技有限公司产品；HH-4型恒温水浴锅，上海力辰仪器科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 紫薯花青素浸提液制备

选取新鲜、无腐烂的紫薯→洗净→切块→磨浆（5%柠檬酸水溶液，料液比1∶15） →浸提（温度55 ℃，时间2 h） →冷却备用。

1.2.2 大孔树脂预处理

先用无水乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，蒸馏水洗至无醇味儿为止；再用5%盐酸浸泡12 h，蒸馏水洗至中性；5%氢氧化钠浸泡12 h，蒸馏水洗至中性，室温下晾干，备用。

1.2.3 静态吸附能力的筛选

用电子天平分别称取每种树脂5 g，然后分别进行装柱编号，吸取10 mL 备用的紫薯果浸提液匀速上样，经1 h 充分吸附后，分别收集树脂流出液，于波长542 nm 处分别测定各流出液的吸光度A1，并计算其吸附率α，筛选出高吸附率的树脂。树脂吸附率的计算公式如下：

式中：A0——提取液在波长542 nm 处的吸光度；

A1——大孔树脂充分吸附紫薯花青素后流出溶液的吸光度。

1.2.4 解析率的筛选

根据树脂的静态吸附率，初步选出对紫薯花青素吸附效果较好的大孔吸附树脂，进行解析力的筛选。分别使用30 mL 用70%乙醇溶液匀速洗脱已经筛选出的树脂，30 min 后分别收集流出液，于波长542 nm 处分别测定其吸光A2，并根据下列公式计算其解析率δ，筛选出解析率较大的大孔吸附树脂。解析率的计算公式如下：

式中：A2——吸附饱和的树脂经乙醇解析后流出液的吸光度。

1.2.5 上样载量对大孔吸附树脂吸附效果的影响

分别取10 mL 已经筛选出的大孔吸附树脂，分别进行装柱，用 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 BV（1 BV 为1 个树脂床体积） 的紫薯花青素浸提液分别对不同的大孔树脂进行上样吸附，分别收集不同载量条件下的流出液并定容至100 mL，于波长542 nm 处测定其吸光度，并比较其最大的上样载量大小。

1.2.6 洗脱剂体积分数对解析效果的影响

分别取5 g 已经吸附饱和的筛选出的大孔吸附树脂装柱，分别设定30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100% 8 个洗脱剂乙醇的体积分数，分别用30 mL 不同体积分数的乙醇在室温条件下进行解析，30 min 后分别收集流出液，稀释一定倍数，于波长542 nm 处测定其吸光度。

1.2.7 样品pH 值对大孔吸附树脂吸附效果的影响

用盐酸或氢氧化钠溶液将pH 值为3.03 的紫薯浸提液配置成不同pH 值溶液，分别设为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.5，然后分别取 10 mL 对筛选出的树脂上样吸附，1 h 充分吸附后，分别收集流出液，于波长542 nm 处测定其吸光度。

1.2.8 使用次数对大孔吸附树脂吸附效果的影响

分别用10 mL 紫薯浸提液对筛选出的3种大孔吸附树脂进行上样吸附，经1 h 充分吸附后，分别收集流出液，10 mL 定容，静置10 min 后，分别于波长542 nm 处测定其吸光试，再用70%乙醇溶液30 mL 洗脱大孔吸附树脂，上述操作重复10 次。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂静态吸附结果

10种大孔吸附树脂的吸光度及吸附率见表1。

测得紫薯浸提液的吸光度A0=1.075。由表1 可知，当紫薯浸提液上样量为10 mL 时，不同型号的大孔吸附树脂对紫薯花青素吸附能力差异较大。根据大孔吸附树脂吸附紫薯浸提液的吸光度越小，其吸附率越大，吸附效果越好。因此，筛选出吸附效果较好的 5种树脂分别为 D101，AB-8，RAS07，NKA-II，RAS80，室温下，5种大孔吸附树脂吸附率均可达到90%以上。因为吸附率主要与树脂极性、溶液极性和大孔树脂表面积等有关[10]，筛选出的5种树脂都为非极性树脂，花青素类物质属于弱极性化合物，且有一定的极性和亲水性，因此易被弱极性或非极性树脂的吸附[11]。

表1 10种大孔吸附树脂的吸光度及吸附率

2.2 大孔吸附树脂解析率结果

5种大孔吸附树脂的吸附率和解析率见表2。

表2 5种大孔吸附树脂的吸附率和解析率

解析率也是衡量大孔吸附树脂纯化紫薯花青素性能的重要指标[12]，由表2 可知，当上样量为10 mL 时，大孔吸附树脂解析率大小为D101＞AB-8＞RAS80＞RAS07＞NKA-II。综合吸附率和解析率2 个指标，从而筛选出3种对紫薯花青素浸提液吸附效果较好的大孔吸附树脂：D101 型，AB-8 型，RAS80 型大孔树脂，其解析率可达80%以上，D101 型树脂的解析率达到了90%以上。

2.3 样品上样载量对大孔吸附树脂吸附效果的影响

树脂性能的优劣除与吸附率、解析率有关外，还与其对有效成分的吸附载量密切相关，也是制约其应用于生产的重要因素。

样品上样载量对大孔吸附树脂吸附效果影响见图1。

图1 样品上样载量对大孔吸附树脂吸附效果影响

由图1 可知，流出液的吸光值随着上样体积的增加逐渐增加，即筛选出的3种大孔树脂对紫薯花青素吸附能力随上样体积增加而降低。当流出液吸光度达到上样紫薯花青素溶液吸光度1/10 时，认为已有花青素透出，即只要吸附后的流出液中出现紫薯花青素大孔树脂就已达到最大吸附量。D101 型，AB-8 型，RAS80 型大孔树脂的上样液体积分别达7，9，8 BV 时树脂已经不能再吸附。由此可知，在大孔吸附树脂柱体积相同的条件下，树脂吸附紫薯花青素的能力是有限的且与上样载量有关。一般最佳的上样载量应为2～4 BV。

2.4 洗脱剂体积分数对解析效果的影响

乙醇体积分数对大孔吸附树脂紫薯花青素解析率影响见图2。

图2 乙醇体积分数对大孔吸附树脂紫薯花青素解析率影响

由图2 可知，随着乙醇体积分数的增大，解析率呈上升趋势。当乙醇体积分数为70%时AB-8 大孔吸附树脂解析率最大；乙醇体积分数为60%时D101 型大孔吸附树脂解析率最大；乙醇体积分数为80%时RAS80 型大孔吸附树脂解析率最大，故分别用70%左右的乙醇解析大孔树脂上吸附的紫薯花青素效果最好，很好地说明大孔树脂适合在水溶液中进行吸附。

2.5 上样液pH 值对大孔吸附树脂的吸附效果影响结果

浸提液pH 值对3种大孔吸附树脂吸附能力的影响见图3。

图3 浸提液pH 值对3种大孔吸附树脂吸附能力的影响

不同类型大孔吸附树脂在吸附时所要求的紫薯花青素浸提液最适pH 值也有所区别。由图3 可知，在 pH 值 2.0～4.0，随着 pH 值的升高 RAS80 型大孔吸附树脂吸附紫薯花青素的吸附率逐渐增大；pH 值4.0 时吸附率最大；在pH 值4.0～5.5，随着 pH 值的升高其吸附率急剧下降，可能是紫薯花青素在不同pH 值溶液中稳定性不同所造成的[13]。所以当粗提液pH 值增大时，花青素的稳定性下降，其吸附率发生变化。AB-8 型大孔吸附树脂在pH 值2.5 和pH 值3.0 处吸附紫薯花青素的吸附率较高，且随着pH 值的升高其吸附率几乎不变化，因为紫薯花青素因离子化趋势而不易被吸附[14]，但pH 值2.5 时花青素易水解，故选择pH 值3.0。随着pH 值的升高，D101型大孔吸附树脂的吸附率逐渐减小，在pH 值2.5 和pH 值2.0 时吸附率较高，选择pH 值2.0。

2.6 大孔吸附树脂重复使用次数对其吸附效果影响的分析

3种大孔吸附树脂重复使用次数对其吸附效果的影响见图4。

图4 3种大孔吸附树脂重复使用次数对其吸附效果的影响

由图4 可知，随着使用次数的增加，紫薯浸提液经3种大孔吸附树脂吸附后流出液的吸光度逐渐增加，表明其吸附能力逐渐下降，树脂性能变差。因为大孔吸附树脂一般存在树脂中毒的现象，在重复使用多次以后，其吸附能力会明显减弱，引起中毒的原因有蛋白质、多糖中毒等[15]。同时，在使用第10 次时流出液的吸光度几乎不变化，可以推断出这3种大孔吸附树脂在使用后需要再生。RAS80 型大孔吸附树脂重复使用多次后吸光值相对于D101 型，AB-8 型大孔吸附树脂变化较明显，流出液的吸光度较大，表明其多次使用后吸附性减弱甚至消失，从经济方面考虑，不选择RAS80 型大孔吸附树脂吸附紫薯花青素。

3 结论

利用大孔吸附树脂法分离纯化紫薯花青素方便可行，大孔吸附树脂吸附紫薯浸提液中的花青素后，再通过70%乙醇溶液洗脱，可得到纯度较高的花青素，而且树脂可循环再生，反复使用，既节约资源又降低成本，是分离和提取紫薯花青素的良好方法。通过对10种大孔树脂的静态吸附、解析性、载量、使用次数等影响因素研究，筛选出适合纯化紫薯中花青素吸附性和解析性较好的2种大孔吸附树脂：AB-8 型和D101 型。利用AB-8 型和D101 型大孔吸附树脂吸附时，紫薯花青素浸提液pH 值应控制在2.0～3.5，洗脱剂体积在70%左右，载量8，9 BV。不适合吸附紫薯花青素的8种大孔吸附树脂：NKA-9 型，NKA-II 型，RAW01 型，RAW16 型，RAW19(H)型，RAW(92)型，RAS07 型，RAS80 型。