Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路在正畸牙周组织改建中的表达及调控机制

袁熳 综述 张疆弢，梅梅 审校

遵义医科大学附属口腔医院正畸科一组，贵州 遵义 563000

正畸牙齿移动是在机械刺激下引起的牙周组织改建即牙槽骨重塑过程，施加在牙齿上的机械刺激通过牙周膜传递到牙槽骨，导致压力侧的骨吸收和张力侧的骨形成[1]。牙周膜(PDL)细胞成分主要由成纤维细胞样细胞组成，但PDL组织还具有一个多潜能的间充质干细胞群，分化为成骨细胞和成牙骨质细胞[2]。牙周膜干细胞(PDLSCs)在牙周组织中具有再生组织的功能，包括PDL和牙骨质[3]。在正畸牙移动过程中，牙周膜干细胞可诱导牙周膜细胞成骨分化及参与牙周组织新陈代谢的调控、牙周组织改建，促进正畸牙移动。牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblast，PDLF)是牙周膜细胞的主要细胞类型，它们在受到包括机械细胞变形在内的多种刺激下分化为成骨细胞[4]。牙周膜持续受到各种机械力的影响，这些机械载荷由牙周膜成纤维细胞接收后[5]，将物理信号转化为生物化学信号和特定基因的表达，组织对机械信号的转导可激活一系列信号通路转导途径，各种研究表明，施加力可以激活PDLSCs中不同的信号通路，包括MAPK、TGF-β/Smad和Wnt/β-catenin通路[4]。有研究表明，机械刺激新生大鼠骨髓间充质干细胞可激活多条非特异性的机械敏感性途径(包括整合素、转化生长因子β/BMP、Akt、MAPK、胰岛素和Wnt 途径)，其活性通过Ras-Raf丝裂原激活蛋白激酶(MEK)-细胞外信号调节激酶(ERK)级联反应来刺激成骨和软骨的形成，然而，Wnt通路在成骨和软骨发生方面的作用不太明显[6]。

Ras-Raf-MEK-ERK轴(也称为Ras-MAPK通路)在细胞信号传导中起着中心作用，基因小鼠模型已经证明了Ras-MAPK通路在软骨细胞和成骨细胞分化和功能中的重要性[7]。越来越多的学者开始关注Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路参与正畸牙移动的相关研究[8]，这将为加快牙周组织改建的速度提供有利数据。

1 Ras-Raf-MAPK/ERK的表达及调控

1.1 肾素-血管紧张素系统(Ras)表达及调控 Ras家族成员由KRAS4A、KRAS4B、HRAS和NRAS组成。Ras是一种膜结合的小GTP酶，它可以传达对各种细胞外信号的反馈[9]。经典Ras 具有多种效应蛋白，包括Raf(ARaf、B-Raf 和C-Raf)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和Ral 鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)。Ras 主要效应因子是AngⅡ[10]。AngⅡ可通过ERK信号通路加快成骨细胞的表达、分泌成骨相关因子RANKL，并使其与表达于破骨前体细胞表面的RANK结合，从而发生破骨过程[11]。有研究与诱导成骨细胞分化及与机械应力介导的MAPK 通路下调相关的下游分子，Ras 可能代表MAPK 通路中参与成骨细胞反应的靶点[7]。当Ras受到多种细胞表面受体的刺激时，ERK1/2被激活。活化的Ras 刺激c-Raf，后者反过来磷酸化ERK1/2 的主要上游磷酸化物MEK1，活化的MAP激酶随后可磷酸化下游底物，以调节细胞增殖、分化和凋亡[12]。在力介导的生长抑制过程中，Ras通过激活MAPKs将机械信号转移到细胞核中，发现p38 MAPK 激活与Ras 信号传导相关，因为用特异性抑制剂抑制Ras 时，p38 MAPK 活性即被抑制，并增加了细胞的DNA 合成[5]。有研究表明，Ras抑制剂几乎完全阻止了p-p38 MAPK和p-p21 的张力介导的增加，以及牙周膜成纤维细胞(PLF)的增殖，在张力作用下Ras 可以激活PLF 中的Ras-p38 MAPK 通路[5]。在HPDLCs中，诱导白细胞介素-11 (IL-11)表达的信号通路是通过AT2 受体介导的，通过拉伸负荷和rhAng Ⅱ治疗，转化生长因子β1(TGF-β1)的表达增加，TGF-β1也诱导人成纤维细胞中IL-11基因的转录。IL-11是IL-6家族的一员，可以作为一种促炎性细胞因子，对拉伸牙周膜成纤维细胞具有成骨作用。总的来说，这些数据清楚地表明RAS参与了拉伸载荷下HPDLCs中IL-11的产生。以前的研究表明IL-11对PDL细胞有成骨作用[13]。即RAS参与了正畸牙周组织改建过程。拉伸应变和血管紧张素(AngⅡ)表达的上调通过血管紧张素(AT2)受体和Ras促进IL-11的产生[14]。此外，Ras是MAPKs、ERK1/2和p38 的上游介导因子，ERK1/2 介导的Runx2 激活依赖于Ras。Runx2是成骨过程中最早连续表达的蛋白质，是一种特定转录调节因子，它标志成骨分化的开始，并且在成骨细胞分化和骨形成中起重要作用[15]。有报道称，整合素介导的Ras相关信号转导级联为ECM-整合素引发的MAPK相关细胞内事件提供了主要途径，因为信号在Runx2 激活期间进入了Ras-MEK-ERK 途径。Westernblot 分析显示Ras 信号的缺失抑制了ERK1/2信号传导[16]。RAS可以激活RAS/MAPK信号通路中的RAF-1。RAF-1直接参与ERK的激活，基因小鼠模型已经证明了Ras-MAPK 通路在软骨细胞和成骨细胞分化和功能中的重要性[7]。Ras 信号转导与力诱导的PLF 生长抑制密切相关，Ras 通过激活MAPKs将机械信号传递到细胞核，机械转化整合素受体的起始因子，可触发衔接蛋白的下游激活，如黏着斑激酶(FAK)、Rho 家族蛋白和小窝蛋白。整合素FAK-Ras-MAPK 信号级联可能与成纤维细胞的机械传导密切相关[5]。有研究证明，受体抑制剂氯沙坦(LOS)通过阻断AT1R后，破骨细胞的募集和活性降低，首次表明了LOS通过对Ras的阻断，减少了机械力诱导的骨重塑，正畸患者如长期使用Ras抑制剂可能会减缓牙齿的移动，延长治疗时间[10]。这些研究表明Ras-MAPK通路在骨软骨祖细胞的分化以及成骨细胞的功能中具有重要作用。

1.2 Raf 表达及调控 Raf 蛋白是Ras 蛋白的主要效应器[9]。Raf能被Ras家族的小GTP酶引导激活，不活跃的Ras-GDP受到上游受体的生长因子刺激下，在质膜中转化为活跃的Ras-GTP 形式[17]，促使Raf 向膜转移并形成Rafa-Ras-GTP复合物[18]。Raf激酶激活后，进一步磷酸化而激活激酶MEK1 和MEK2，激酶MEK1和MEK2磷酸化后并激活ERK1和ERK2[19]。最近的数据表明，Raf激酶结构域的二聚化是Raf激活中Ras调控的中枢事件，Raf激酶家族构成Ras-Raf-MAPK/ERK信号级联反应的核心成分[20]。有研究表明，在仅表达C-Raf的细胞中，ERK被灭活并抑制增殖，而在表达B-raf的细胞中，ERK被激活并诱导增殖。该实验已被证明对成骨细胞有效，此外有体外实验结果支持Raf/MEK/ERK 通路在软骨细胞增殖中的作用[21]。RAF 通过MAPK/ERK 将激活的RAS 蛋白信号传递给ERK1/2，这是该通路的关键效应器，研究证实RAF-1与细胞增殖和成骨细胞分化有许多联系[22]。有研究表明，在小鼠成纤维细胞中，癌基因和生长因子诱导的COX-2转录需要Ras 依赖的Raf-1/MAPKK/ERK 激活。也有数据表明Ras/Raf-1/MEK/ERK/IKKab 和NF-kB 通路的激活是超声诱导前成骨细胞所必需的[8]。

1.3 MAPK/ERK表达及调控 MAPKs由一系列高度同源的蛋白激酶组成，主要是ERK、c-Jun 氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)/应激激活蛋白激 酶(stress-Activated protein kinase，SAPK)、p38 和ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶(bigmitogen-Activated protein kinase 1，BMK1)四个家族成员[23]。MAPK信号通路与破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成密切相关。体外细胞研究表明，间歇机械力和10%的周期性张力可激活人PDLCs (hPDLCs)中ERK1/2和p38mapk信号通路[24]。RasGTP 酶可介导细胞外有丝分裂信号引起级联激活[25]，MAPK 激酶(MAPK-kinase kinase，MKKK)受有丝分裂原刺激磷酸化，激活MAPK 激酶(MAPK kinase)，MKK 进一步磷酸化，激活MAPK，即按照三级激酶级联方式传递信号，使其转入细胞核内活化，进而参与细胞免疫炎症反应、增殖、分化[26]。大量研究表明，机械力在牙周组织中启动MAPK信号通路，在MAPK信号中，ERK1/2是调节细胞存活、分化和增殖的最显著的激酶，而且ERK1/2信号还被证明参与牙根形成和再生过程中的细胞增殖和分化[27]。机械应力刺激使得骨髓间充质干细胞中的ERK1/2-Runx2细胞内途径激活，并介导这些细胞分化为骨形成成骨细胞。通过ERK1/2、JNK或p38选择性激活MAPK细胞内信号通路，特别是p38级联，上调成骨细胞产生炎性细胞因子和RANKL，从而启动破骨细胞生成并促进骨重塑，进而促进正畸牙槽骨改建[28]。牙周膜干细胞具有骨形成能力，用于治疗牙周炎等疾病，当与诱导成骨分化的蛋白质结合使用时，它们的治疗潜力增加。例如，骨形态发生蛋白-9(BMP9)被发现具有强大的成骨活性。骨生成标记物的水平，如Runt 相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)以及矿化能力被测量。结果表明，骨形态发生蛋白9 促进了牙周膜干细胞的骨形成。在其他实验中，分别作为p38 和ERK1/2 抑制剂的SB203580 和PD98059 被用来确定这些激酶是否参与成骨分化过程。由此得到的蛋白表达谱和成骨标记揭示了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路可能在BMP9 诱导的成骨分化过程中起重要作用[29]。有研究证实ERK1/2和p38 的mRNA 表达水平在正畸牙周组织和hPDLCs离体牙周组织中被上调并正调控成骨相关基因的表达水平，ERK1/2和p38mapk通路与正畸牙周组织重塑密切相关[30]。这些发现有助于进一步研究正畸牙移动后牙周组织中潜在的分子机制，以及靶向ERK1/2 和p38mapk信号通路的药物的开发[24]。

2 Ras-Raf-MAPK/ERK 在正畸牙周组织改建中的表达及调控

机械应力对于成骨细胞活性的调节对牙周重建具有重要意义，在22 个丝裂原活化蛋白激酶(MAP3Ks)中，确定了A-Raf 和C-Raf 为机械牵张活化ERK 通路的上游信号分子[31]。在骨髓间充质干细胞中，机械诱导的菌株激活了MAPK信号通路的成员分子ERK 1/2，反过来，ERK 1/2通路激活成骨基因表达的关键调节因子即Runx 2转录因子[32]，使成骨前体细胞分化和成熟为成骨细胞。MAPK的胞内信号通路对成骨细胞产生炎性细胞因子和RANKL起上调作用，从而启动破骨细胞的生成和促进骨的重塑即牙周组织改建。通过ERK 1/2、MAPK细胞内信号通路的选择性激活取决于组织应变的大小，而在正畸治疗中，组织应变的大小取决于所施加的正畸力的特性[28]。机械应力刺激增加ALP 活性、Ⅰ型胶原表达、ATP 和Ca2+释放，促进成骨分化[33]。研究表明，Ca2+、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)等可以激活Ras-Raf-MAPK/ERK 信号通路，从而介导细胞反应[25]。1个G蛋白偶联蛋白Ras、3个蛋白激酶Raf-MEK-ERK可以组成Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路。

位于成骨细胞上的AT1R可能触发活性氧(ROS)，影响RAS，进而影响细胞外信号调节激酶(ERK)和p38促丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，两者均调节NF-κB、导致骨钙蛋白(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、IL-1、IL-6、TNF-α、MMP 和RANKL 等各种成骨相关因子的产生[34]，ERK 和p38 MAPK 能促进张应力诱导的成骨分化相关基因的表达[35]。人们普遍认为，成骨调控与多种信号通路有关，是一个复杂的过程[32]。正畸牙槽骨重塑中成骨细胞和破骨细胞中hPDLCs 发挥着重要作用[36]。机械应力通过激活MAPK 信号转导通路和Ras/Raf依赖的ERK1/2激活来调节Runx2的激活，从而促进成骨细胞的分化，而不依赖于p38 MAPK信号[16]。力学信号转导的重要途径是MAPK通路，而力学信号转化为生物学信号是整合素通过MAPK通路向细胞核传递。整合素激活后，Runx2的转录活性升高，力学信号通过MAPK信号通路使ERK1/2同Runx2结合，进一步使Runx2磷酸化，从而调控成骨细胞分化[37]。整合素受体是机械转导的引发剂，整合素-FAK-Ras-MAPK信号级联可能密切参与成骨细胞的机械转导[38]。应用RAS抑制剂不止抑制了p38MAPK，而且还抑制了在施加张力时PLF(成纤维细胞)中p-ERK 的增加，这表明RAS 抑制剂可能影响正畸牙槽骨改建速度。研究发现FAK 信号可与ERK-ELK1 和ERK-c-Fos 作为下游效应物相互影响，在PLF中起着至关重要的作用。通过对PLF施加张力时，Ras-p38 MAPK信号被活化，从而上调p21，而PLF 感应机械力的能力进一步影响正畸牙的移动速度[39]。

最近的研究表明，微小基因RNA21 (miRNA21)能够通过激活MAPK信号通路，促使ERK磷酸化，进一步使RANKL高表达，提升小鼠正畸牙齿移动速度[40]。LI等[41]认为，转化生长因子TGF-β3可能激活p38 MAPK途径，促进hPDLSCs的成骨分化。有研究证明通过弱激光照射后诱导MAPK/ERK1/2 的磷酸化，通过MAPK/ ERK 信号传导增加成骨细胞分裂和迁移，改善骨组织的再生，促进了正畸牙张力侧牙周膜细胞的成骨分化，进而加速牙槽骨的改建[42]。此外，有文献报道，在周期性牵张力(cyclic stretch，CS)作用下人牙周膜细胞中的p-ERK表达增加，提示周期性牵张力诱导牙周膜细胞中MAPK/ERK信号通路的活化，促进牙周膜细胞成骨分化以及MMP-1、MMP-2的表达[43]。孙琼等[44]认为，当牙周膜干细胞中PELP1蛋白呈高表达时，Ras下游激酶c-Raf 和MEK 被激活，可通过Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路影响牙周膜细胞成骨分化能力。许多研究表明，ERK1/2 和p38MAPK 参与了机械刺激诱导的成骨分化，流体剪切应力(FSS)在15～30 min 内迅速激活ERK1/2 和p38，提示MAPK 通路的激活是FSS 刺激hPDLCs的早期事件[30]。宋京等[45]在体外培养牙周膜细胞，建立力学刺激模型，加力组的p-ERK1/2蛋白水平比对照组明显升高(P＜0.05)，其中在加力1 h和3 h达到最高(P＜0.01)，Runx2蛋白水平在加力3 h和6 h时明显升高(P＜0.01)。这表明，在周期性牵张力作用下，牙周膜成纤维细胞内ERK1/2 通路可以被激活，进而调控牙周膜细胞的成骨分化。另外有文献证明，MAPK-ERK途径可由TGF-β激活，该途径上调泛素连接酶SMURF1 的表达，抑制成骨细胞分化，并减少成骨蛋白的存在。ERK1/2 抑制剂使骨形态发生蛋白BMP-2成骨活性的增强表明，它可能在骨折修复中具有促进成骨的潜在临床实用性[46]。

3 展望

近年来，Ras-Raf-MAPK/ERK 信号通路已被证实与正畸治疗中牙周组织的改建密切相关，该通路活化后可促进成骨细胞和破骨细胞的分化与增殖，综上所述，在各种不同的外界因素刺激下，不同大小的力，作用时间和频率不同，激发的MAPK通路及作用也会不同，成骨分化标志物的表达也会不尽相同。因此，对成骨细胞及破骨细胞分化增殖和所涉及的Ras-Raf-MAPK/ERK信号通路作用机制的深入研究可以帮助临床医师选择正确而有效的治疗方法。但正畸牙槽骨改建涉及多因素的调控，其中Ras、Raf 活性的确切影响及MAPK 对hPDL 中生长因子产生的作用尚未清楚[47]，因此进一步研究在外界因素的刺激下牙周膜细胞的机械反应和所涉及的Ras-Raf-MAPK/ERK 信号通路细胞间的转导关系，进一步探讨牙周组织改建的具体机制，以期为临床提供理论依据，可能有助于解决正畸治疗中的挑战，实现在缩短矫治疗程的同时又不影响牙齿移动张力侧和压力侧的动态平衡过程。