细胞焦亡在肿瘤中的作用机制及治疗进展

胡凌煜，吴 斌，钟征翔

(1.嘉兴市第二医院肝胆外科，浙江 嘉兴 314000；2.蚌埠医学院研究生院，安徽 蚌埠 233000)

恶性肿瘤是人类面临的最为棘手的疾病之一，近年来发病率逐年增高。恶性肿瘤无法根治，消耗了大量的社会医疗资源，国内外大量的研究者为此致力于癌症研究。肿瘤有许多的表型它们是导致肿瘤细胞生长和转移的基础，抵抗细胞死亡是其的重要表型之一[1-2]。正常细胞的增殖和死亡是相对平衡的，而肿瘤细胞的生长是不受控制的，以往研究认为肿瘤中的细胞凋亡(Apoptosis)出现了问题。细胞凋亡作为程序性细胞死亡的一种形式，其自主的细胞裂解不会引起炎症，并积极参与肿瘤细胞的生死平衡过程。在之前的几十年间，凋亡在肿瘤领域被广泛研究报道，近年来出现一种新的细胞死亡方式—细胞焦亡(Pyroptosis)。细胞焦亡被认为是一种全新的程序性细胞死亡方式，1992年巴斯德研究所在福氏志贺菌感染的巨噬细胞中首次观察到这种特殊现象。2000年，Brennan等研究发现沙门氏菌通过一种依赖于caspase-1介导的炎性坏死机制引起巨噬细胞死亡，并提出了“细胞焦亡”这一概念。2018年，细胞死亡命名委员会(NCCD)正式建议将细胞焦亡定义为调节性细胞死亡(Regulated cell death，RCD)的一种形式。相比于细胞凋亡，细胞焦亡的发生更快、更剧烈，并伴随大量促炎症因子的释放。因此，深入研究这种死亡效应有助于从新的角度揭示肿瘤细胞死亡机制，对于开发肿瘤治疗新策略具有重要意义。本文就细胞焦亡及其在肿瘤中的相关研究进展做一综述，以期能够为肿瘤治疗提供新思路。

1 细胞焦亡与细胞凋亡的异同

虽然细胞焦亡与细胞凋亡存在一些类似的形态学特征，如DNA损伤、核固缩、Tunel和Annexin-V染色阳性等，但是它们之间也存在许多不同。首先，细胞焦亡的DNA损伤形式非常特殊，焦亡细胞虽然经历染色质凝结和DNA断裂，但它的细胞核仍保持完整，细胞膜上形成众多1～2 nm的孔隙，使细胞膜失去完整性，破坏了膜两侧的离子平衡，最终导致细胞膜溶解，释放出细胞内容物。当细胞受到内源危险信号时,Caspase-1由NLRP1、NLRP3、和Pyrin等典型的炎性小体激活,一方面,通过切割Gasdermin家族蛋白使其N-、C-两端的结构域分开,进而释放N-端的片段在膜上寡聚化穿孔,导致细胞渗透压变化、胞膜破裂和内容物释放,发生焦亡并启动炎症反应的发生;另一方面,Caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18,形成IL-1β和IL-18释放到胞外，诱发剧烈的炎症反应。而在细胞凋亡中DNA的损伤依赖于caspase-3 激活的DNA酶—CAD(caspase-activated DNase)与其抑制剂ICAD的结合，这在细胞焦亡中是不需要的，直接通过Caspase-1即可裂解CAD。近期有研究报道,凋亡过程中Caspase介导质膜上的pannexin-1通道的开放会释放一些代谢产物，Caspase也能抑制炎性蛋白质的翻译和一些炎性因子的分泌,从而抑制炎症反应，并促进伤口愈合[3]。但是在某些情况下,凋亡过程中,会伴随炎性因子的释放,从而引发机体炎症发生，这类炎症反应通常并不剧烈[4]。Caspase作为一组在胞质中具有类似结构的蛋白酶，广泛参与了细胞的生长、分化调节。其既能介导细胞凋亡，又能介导细胞焦亡。研究表明细胞凋亡依赖caspase-6/7介导，而细胞焦亡则依赖caspase-1/4/5(人体内)和caspase-11(小鼠体内)介导。此外，细胞凋亡受ATP水平的影响，DNA修复酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)可被DNA损伤激活，引发ATP的消耗。在细胞凋亡过程中可以通过抑制caspase-1影响PARP，以调控ATP水平，但细胞焦亡不受PARP激活调控[5]。

2 细胞焦亡的相关分子机制

细胞焦亡是程序性细胞死亡的一种炎症形式，由gasdermin蛋白家族所介导，目前在人类中有6个同源基因即GSDMA，GSDMB，GSDMA，GSDMD，GSDME(也被称为DFNA5)和PJVK(也被称为DFNB59)，被caspase-1/4/5/11激活并并切割。以GSDMD为例，其可被可被成两部分：位于N端的GSDMD-N和C端的GSDMD-C。GSDMD-N与细胞膜上的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰丝氨酸连接，从而触发聚集，导致孔隙的形成[6-7]。据报道，孔隙的内径约为15 nm，外径约为32 nm，而IL-18的直径约为4.5 nm，因此其可以顺利通过这些孔隙[8]。这些孔隙导致细胞膜两侧离子浓度平衡性被打破，细胞肿胀，质膜溶解，染色质碎裂和细胞内促炎成分的释放后导致死亡，即发生焦亡。目前，研究较多的是依赖caspase-1的经典通路和依赖caspase-4/5/11的非经典通路。

2.1 依赖caspase-1的经典通路在依赖caspase-1的经典通路中，炎性小体通过模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)识别病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)并激活caspase-1。经典的炎性小体包括NLRP1/3，NLRC4和AIM2，它们都具有位于N端的热蛋白结构域(PYD)或位于C端的半胱天冬酶募集结构域(CARD)。凋亡相关斑点样蛋白(ASC)利用PYD和CARD结构域同源蛋白相互作用来招募NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)和pro-caspase-1，从而组装成炎性小体。ASC在这个过程中聚集形成大分子二聚体—ASC斑点(ASC-speck)，ASC斑点招募pro-caspase-1并激活caspase-1，活化的caspase-1切割焦亡执行蛋白GSDMD，切割产生的GSDMD-N在细胞膜上打孔形成非选择性通道，破坏细胞膜两侧离子的平衡，导致细胞肿胀、裂解并最终死亡。此外，活化的caspase-1也可切割和加工pro-IL-18和pro-IL-1β(IL-18和IL-1β的前体)，将成熟体IL-18和IL-1β分泌至细胞外，介导炎症性死亡即细胞焦亡。有研究表明，GSDMD也可影响成熟的IL1β的分泌。

2.2 依赖caspase-4/5/11的非经典通路在非经典通路中，作为革兰阴性菌的细胞壁成分的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是激活 caspase-4/5/11非经典通路的关键，被激活的caspase-11(小鼠体内)/ caspase-4/5(人体内)可通过裂解GSDMD形成GSDMD-N在细胞膜上打孔形成非选择性通道，导致细胞焦亡。随着研究的深入，有报道发现活化的 caspase-4/5/11 也可通过活化 Pannexin-1 等通道来调控炎性介质分泌至细胞外。

2.3 执行蛋白及caspase-3/8介导的通路Caspase-3则长期以来一直被认为是细胞凋亡的重要标志。然而最近，Wang等发现caspase-3可以影响和激活GSDME促进焦亡的发生。在GSDME高表达的肿瘤细胞系中，化疗药物可诱导caspase-3活化并裂解GSDME，产生的GSDME-N可在细胞膜上打孔引起肿瘤细胞焦亡[5]。Sarhan等研究报道了致病性耶尔森氏菌通过效应因子YopJ抑制TAK1的过程中caspase-8可切割GSDMD(鼠巨噬细胞中为GSDME)，介导了细胞焦亡发生[9]。

2.4 丝氨酸蛋白酶GZMA介导的通路最近，绍峰课题组首次发现gasdermin可在非Asp位点经丝氨酸蛋白酶GZMA水解执行打孔功能，并将经细胞毒性淋巴细胞诱导的细胞死亡证明为焦亡，这项发现改写了焦亡只能经Caspase活化的定论。细胞毒性淋巴细胞(如CTLs，NK细胞等)中的丝氨酸蛋白酶Granzyme A可以经穿孔素(perforin)进入靶细胞，通过水解Gasdermin B(GSDMB)分子Lys229/Lys244位点诱导靶细胞发生焦亡。GSDMB存在组织特异性表达，并在消化系统上皮细胞源肿瘤细胞中呈高表达，而通过GSDMB诱导焦亡将增强抗肿瘤免疫，将成为这些肿瘤治疗潜在靶点[10]。

3 细胞焦亡在肿瘤中的相关研究进展

3.1 胃癌及食管癌研究发现，胃癌细胞中的GSDMD表达量较临近的正常组织细胞少，这可能促进了癌细胞的增殖。Wang等的研究发现GSDMD通过抑制胃癌(GC)细胞中的ERK1/2、STAT3和PI3K/AKT，从而使得Cyclin A2和Cyclin Dependent Kinase(CDK2)的表达降低。因此GC细胞中GSDMD表达量的减低，使得Cyclin/CDK复合物作为调控细胞周期的物质表达增加，促进S期向G2期过渡，加速GC细胞增殖[11]。此外，该研究还发现GSDME也是Gasdermin超家族成员之一，化疗作用时与GSDMD具有相同的孔隙形成作用的GSDME可被caspase-3激活。Yin B等研究报道，用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理GC细胞(SGC-7901和MKN-45)，发现细胞活力明显下降。5-FU处理后的细胞膜上有大的气泡吹出，caspase-3激活使GSDME裂解，GC细胞发生焦亡[12]。细胞焦亡在食管癌中也有报道。Wang,F.等报道了酒精诱发食管炎并通过细胞焦亡参与了食管癌的发生和发展，进一步研究发现caspase-1的抑制剂Ac-YVAD-CMK在体内和体外均可有效抑制IL-1β和IL-18的表达，减少炎症反应，有望成为抑制食管炎向食管癌进展的药物[13]。最近Wu,M.等的一项研究表明GSDME在食管癌细胞中的表达高于正常细胞，GSDME高表达和焦亡发生相关[14]。研究中PLK1抑制剂BI2536通过诱导脓毒症，增加了食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞对顺铂(DDP)的敏感性。低剂量的BI2536与DDP结合后，激活了细胞凋亡相关蛋白BAX和caspase-3，导致GSDME的裂解，增加了DNA损伤，诱导焦亡。

3.2 结直肠癌结直肠癌方面，Derangere,V.等首次报道了在LXR激动剂的介导下，LXRβ能与pannexin-1结合并触发其开放，导致ATP的分泌。细胞外的ATP可聚集炎性小体NLRP3，随后通过P2X7受体(一种ATP门控离子通道)途径激活caspase-1，导致结肠癌细胞发生焦亡。Ma,Y.等前期研究表明LncRNA RP1-85F18.6在结直肠癌中高表达，可在转录和翻译水平上调控ΔNp63(其作用与p53相反)，从而参与了结直肠癌细胞的增殖、侵袭、存活、转移过程，包括抑制肿瘤细胞的凋亡。值得注意的是，LncRNA RP1-85F18.6还参与了结直肠癌细胞的焦亡过程。LncRNA RP1-85F18.6下调通过沉默ΔNp63以及裂解GSDMD，诱导CRC细胞的焦亡发生。最近，Yu J.等研究发现洛铂可诱导结肠癌细胞激活caspase-3/9，通过GSDME介导的ROS/JNK/Bax-线粒体凋亡途径使细胞发生焦亡。在洛铂诱导激活HT-29和HCT116结肠癌细胞中的caspase-3/9后，GSDME被裂解，诱导活性氧物种(ROS)升高和JNK磷酸化。激活的JNK将Bax招募到线粒体，从而刺激细胞色素c释放到细胞质，使肿瘤细胞发生焦亡。进一步研究洛铂通过这种途径杀死肿瘤细胞的机制，可能对化疗药物的临床应用具有重要意义[15]。

3.3 肝癌Chu,Q.等研究发现在肝癌细胞系 Bel-7402 和 HepG2 中caspase-1的表达显著低于正常肝细胞系HL-7702。进一步研究发现焦亡通路激活对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，而Ac-YVAD-CMK(caspase-1抑制剂)可削弱该作用。同时发现小檗碱(一种黄连中提取的生物碱)可以通过上调caspase-1，促进IL-1β表达，进而抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。Wei,Q.等报道了雌二醇(E2)诱导的NLRP3炎性体激活可能在HCC进展中起到抑制作用，可能的机制是触发细胞焦亡并抑制保护性的细胞自噬发生。E2诱导的NLRP3炎性体激活通过E2/ERβ/AMPK/mTOR通路触发细胞焦亡从而在HCC进展中起到抑制作用。3-甲基腺嘌呤(3-MA)可明显增强E2诱导的细胞焦亡现象在，而在Ac-YVAD-CMK治疗下焦亡则被抑制，这表明caspase-1依赖性细胞焦亡受自噬的负调控[16]。

3.4 肺癌焦亡在肺癌的研究中，Gao等研究发现GSDMD在非小细胞肺癌(NSCLC)中相较癌旁正常组织高表达，研究表明敲除GSDMD在NSCLC细胞系和异种移植小鼠模型中能抑制肿瘤的生长，通过促进细胞焦亡向凋亡转化和抑制非小细胞肺癌NSCLC中的EGFR / Akt信号传导而减弱了肿瘤的增殖[17]。Wang等研究报道，抗高脂血症药物辛伐他汀可在NSCLC细胞系和异种移植小鼠模型中通过激活NLRP3来诱导细胞焦亡，从而抑制了肿瘤细胞增殖和转移。此项研究表明，辛伐他汀有可能成为一种新型治疗NSCLC的药物，有较大的应用前景。

3.5 胰腺癌胰腺导管腺癌(PDAC)是一种预后极差的疾病，其发病率逐年上升，目前胰腺癌中的焦亡研究较少 。Cui,J.等报道了哺乳动物STE20样激酶1(MST1)在PDAC中的表达量较低，同时MST1的表达促进了PDAC细胞死亡，并通过caspase-1诱导的细胞焦亡抑制PDAC的增殖、迁移、侵袭。而ROS抑制剂(N-acetyl-cysteine)可抑制MST1 激活caspase-1，以及减弱MST1对PDAC细胞死亡、增殖、迁移和侵袭的影响。研究表明MST1将是一个潜在的预后和治疗PDAC的靶点，对胰腺癌的治疗具有重要意义[18]。

3.6 乳腺癌乳腺癌的焦亡研究中，Omega-3脂肪酸可以调节炎症并发挥抗癌作用，促进癌细胞死亡。二十二碳六烯酸(DHA)是一种具有抗肿瘤作用的Omega-3脂肪酸。Pizato等研究发现，经DHA处理的乳腺癌细胞与未处理的细胞相比，DHA处理的乳腺癌细胞caspase-1被激活，gasdermin D被裂解，IL-1β分泌增强，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)向细胞质转运，膜孔形成，证明DHA可以诱导乳腺癌细胞发生细胞焦亡。另外，Draganov等报道了伊维菌素通过介导P2X4/P2X7-门控的Pannexin-1通道调节细胞外ATP和HMGB1的敏感性，激活caspase-1诱导细胞凋亡和焦亡。Kolb等发现NLRC4炎症小体在肥胖乳腺癌患者的乳腺癌组织中相对过表达，肥胖的乳腺癌小鼠模型的肿瘤微环境诱导肿瘤浸润性髓样细胞增加，激活NLRC4炎性小体，进而激活IL-1β，诱导细胞焦亡，并通过脂肪细胞介导血管内皮生长因子A(VEGFA)表达和新生血管生成，从而促进乳腺癌的进展[19]。

3.7 宫颈癌So等报道，与正常宫颈癌细胞相比，SIRT1在HPV感染的宫颈癌细胞中的表达量更高，且促进癌细胞的生长和增殖。SIRT1在宫颈癌细胞中的表达通过干扰黑素瘤缺乏因子2(AIM2)基因转录因子RelB的mRNA，抑制了NF-κB诱导的AIM2基因的转录。然而，敲除SIRT1可上调AIM2炎性小体相关基因，增强RelB的稳定性，从而介导了AIM2炎性小体依赖性细胞焦亡发生[20]。另外也有文献报道，AIM2作为一种受体识别细胞膜双链脱氧核糖核酸(dsDNA)，具有包括HPV在内的细胞膜dsDNA的功能，能与ASC形成大分子复合物，激活caspase-1介导的细胞焦亡，这在结肠癌中也有类似的报道。由此可见，AIM2可能在宫颈癌等肿瘤中起潜在的治疗靶标作用。

4 展望

越来越多的研究关注于肿瘤中的焦亡现象，目前研究主要集中在激活NLRP1/3、NLRC4和AIM2等炎性小体并促进细胞焦亡的化合物或分子，它们有希望成为治疗肿瘤的新药物。然而，我们对这些分子如何影响肿瘤细胞焦亡的机制通路还没有完全了解。未来朝着阐明焦亡的发生机制研究，将有助于我们提高对肿瘤细胞焦亡的理解，有助于开发出基于细胞焦亡的抗肿瘤药物。同时也需要更多的临床试验来验证焦亡在肿瘤治疗中的价值。