CRISPR/Cas9 技术在疾病治疗中的应用研究进展

郝静然,王少峡

(天津中医药大学中西医结合学院,天津 301600)

规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)基因编辑技术是目前逐渐兴起的一种基因编辑手段,因其操作便捷、简单、快速、精准等特点而在医学研究领域得到了迅速发展,获得了众多研究者的青睐。2012年,Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna发表了一篇关于细菌可以利用CRISPR/Cas9系统来沉默外源入侵的核酸的文章,并对该机制进行了研究,其研究结果显示出该项技术在基因编辑方面的潜力,二人也因该项研究于2020年被授予诺贝尔化学奖[1]。本世纪初以来,针对CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究逐渐兴起,吸引了生物界、医学界等众多科学家们的目光,在医药、农业、工业等领域得到广泛应用,包括基因敲除、基因编辑、基因组筛选等各种基因编辑方向。本文将对此做一简要综述。

1 CRISPR/Cas9系统概述

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中,并利用相应的RNA酶来指导同源序列的降解,从而达到对自身的保护性。研究表明,CRISPR/Cas9基因组编辑系统的构成有内切核酸酶-Cas9和指导RNA-gRNA两个部分。根据CRISPR-Cas位点的不同,可将CRISPR系统分为六种不同的类型,而我们常用的是II型CRISPR系统即CRISPR/Cas9基因组编辑系统,它可以利用单个内切核酸酶-Cas9断裂外源双链DNA。CRISPR位点上有三个功能区—反向转录的特异性非编码RNA(trancrRNA)区、不同cas基因区以及CRISPR array区,三者呈线性排列于一条DNA链上[2]。其中Cas区用来指导切割DNA序列的核酸酶的形成,CRISPR array区包含repeat序列和spacer序列,外源基因入侵时就会插入spacer序列进行转录。其抵抗外源DNA入侵的分子机制是：当某病毒首次感染细菌时,来自病毒的基因组的一个片段会整合到该细菌的CRISPR/Cas9的间隔区；当同一病毒再次感染该细菌时,细菌中已整合外源基因的CRISPR基因将会转录形成一种pre-crRNA,pre-crRNA经过一系列的加工处理可以形成含有与外源基因相匹配序列的crRNA,此crRNA可识别该病毒基因组的同源序列,然后介导Cas蛋白定向到病毒基因组的互补区合并切割相应DNA片段,以保护自身免遭入侵[3]。

2 CRISPR/Cas9系统的应用

2.1 CRISPR/Cas9系统用于疾病机制研究近来CRISPR/Cas9技术在疾病机制研究中成功报道越来越多。研究发现,运用CRISPR/Cas9系统在HepG2肝癌细胞系中构建GSTZ1基因敲除模型,可以探索其对肝癌细胞生长迁移的影响。实验使用慢病毒包装质粒和已含有靶向sgRNA的LentiCRISPR-V2载体共转染HEK293T细胞,得到包装好的慢病毒后再用以感染HepG2细胞,证得GSTZ1基因缺失会明显促进肝癌细胞的迁移和增殖能力,这提示GSTZ1基因可能是肝癌细胞的抑癌基因,参与调控肝癌的发生发展[4]。有研究者利用CRISPR/Cas9系统成功敲除人源结肠癌细胞SAM-HD1基因,实验表明该基因缺失后,结肠癌细胞的增殖能力显著增强,且能抵抗DNA损伤,这不仅有利于人们对结肠癌进行更深入的研究还有助于探究SAM-HD1基因在其他肿瘤中的作用[5]。为探讨亲环素A(CyPA)对于肺癌细胞放射增敏的作用,有实验采用CRISPR/Cas9技术,建立CyPA基因敲除的肺腺癌H1975疾病细胞模型,加入中药扶正增效汤,建立四组实验,最终得出扶正增效汤可能是通过降低CyPA的表达来抑制肺癌细胞的生长存活[6]。也有文献报道可以利用CRISPR/Cas9-SAM系统构建CHD5基因过表达慢病毒载体,用其感染T24细胞后证得细胞内的CHD5基因的mRNA和蛋白的表达均有增加,并且分析得出CHD5基因对于膀胱癌细胞的生长有一定的影响作用[7]。同时,CRISPR/Cas9系统还可以被应用在探究先天性心脏病以及针对HIV、疱疹病毒、人乳头瘤病毒等可能引发病毒感染性疾病的研究中[8-9]。

2.2 CRISPR/Cas9系统用于建立动物疾病模型和筛选新药建立动物模型是新药研发的基础,由于传统基因编辑技术的诸多不便,CRISPR/Cas9技术越来越多的被用于动物模型的建立,该技术不仅具有合成设计简便、遗传稳定、高效率耗时短等优点,还可以对细胞内的多个基因同时进行编辑,建立出与人类疾病相似的动物模型,上述优点让我们看到了该技术的巨大应用潜力。近日有实验为研究Slc20a2基因是否与原发性家族性脑钙化病的发病机制有关,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术联合Cre-LoxP系统构建了敲除纹状体Slc20a2基因的小鼠模型,该组织特异性基因敲除解决了全身性基因敲除可能会导致的胎儿生长受限问题,从而为之后研究该病的发病机制和针对该病治疗药物药物的研究提供了更好的动物模型[10]。CRISPR/Cas9系统还可以被应用在心血管领域的研究中,2017年Chia-Wei Chang等在CRISPR/Cas9技术的介导下建立了人胚胎干细胞FHL2基因敲除细胞系,为心肌病研究与药物筛选提供了疾病细胞模型[11]。细胞色素P450 2J2(CYP2J2)酶是体内重要代谢酶之一,但尚无用于研究药物代谢和药代动力学的CYP2J基因敲除大鼠模型,2020年9月有实验成功建立了敲除人CYP2J2的直系同源基因大鼠CYP2J3 / 10的动物模型,能够为研究CYP2J在药物代谢和心血管疾病中的功能提供有用帮助[12]。为探究Sprr2f基因在肾损伤中的作用,Kieu My Huynh团队使用CRISPR-Cas9技术建立Sprr2f基因敲除(Sprr2f-KO)小鼠模型,研究结果表明Sprr2f基因起一定的肾脏保护作用,给此后针对肾脏用药的药物筛选提供了理论基础[13],这些动物模型的建立为新药的研发奠定了坚实的基础。

2.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于治疗近年来,随着技术的不断创新与完善,研究者们越来越多将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于疾病的治疗。目前已有研究发现利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对巨噬细胞进行改造,当巨噬细胞和其前体单核细胞中出现特异性Cas9蛋白时,再将靶向Ntn1的gRNA(sgNtn1)构入质粒中以敲除巨噬细胞和其前体单核细胞中的Ntn1,可以使其编码蛋白含量下降从而达到缓解Ⅱ型糖尿病的症状的目的[14]。还有研究者发明了一种Cas9/RecA技术,通过提高CRISPR/Cas9基因编辑技术HDR途径的效率来治疗视网膜色素变性,实验研究表明,视网膜色素变性实验小鼠的视力得到了一定程度的修复,该研究为治疗由于单基因突变而引起的眼盲提供了新的临床治疗方向[15]。近来,德国学者Theresa Kaeuferle[16],通过CRISPR/Cas9介导敲除了T细胞内的糖皮质激素受体,获得了抗糖皮质素的病毒特异性T细胞,为正在接受糖皮质激素治疗的移植后病毒感染患者提供了治疗选择。2020年4月27日,卢铀团队在Nature Medicine杂志上发表了CRISPR基因编辑PD-1细胞治疗非小细胞肺癌临床研究成果,该成果表明靶向PD-1的CRISPR基因编辑T细胞回输肺癌患者体内用于治疗肺癌具有安全性及可行性,该实验为全球首个CRISPR人体试验[17]。

3 CRISPR/Cas9基因编辑技术的潜在不足

尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术因其简便、快捷,而被广泛应用在各领域的研究中,但是该技术仍存在一些不足之处,许多文献表明脱靶现象是其最主要的问题。CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性识别功能决定于sgRNA上的识别序列,然而,当研究者基于这一特性做出基因编辑时,所得的基因编辑产物除对特定的基因识别外,也会同其他与特定基因碱基片段相差不大的DNA片段结合而发生错配现象,也就是在真核生物复杂的基因组中,经改造的sgRNA的识别序列可能会与不是靶点的DNA序列发生结合,即脱靶现象的发生。为了降低脱靶现象的发生,研究者们广泛开展了对于Cas9蛋白和sgRNA修饰的研究,修饰后得到的Cas9蛋白和sgRNA能够增加一定的稳定性[18]。此外,2018年,南方科技大学副教授贺建奎利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对婴儿进行基因编辑,使其成为能够天然抵抗艾滋病病毒的婴儿一事一经发生便得到了社会各界谴责,这很明显会为人类社会的发展带来很大的威胁,其引发的伦理问题值得我们思考[19]。

4 总结与展望

从近年来针对于CRISPR/Cas9系统的各项研究报道、各类文献中我们不难发现,该项技术的应用与发展将很有可能帮助人们更深入地了解疾病的发病机制,为靶向治疗提供更多的方向。并且在提倡精准医疗、个体化医疗的现今社会中,该技术的发展也能够更好的推动这类医疗的实施,从而解决临床治疗的一系列难题。相较于传统基因编辑技术,CRISPR/Cas9基因编辑技术在建立动物模型方面也已经凸显出很大优势,该项技术的应用能够确保疾病动物模型准确省时的建立,为新药的研发与药物作用机制的研究提供了极大便利。另外,CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展也可以为中药汤剂的多靶向性作用机制的研究提供更好的方法,并且该技术还可被考虑用于中药优良品种培育和鉴定、分析、改造方面[20],这不仅给医药领域带来了新的希望,也为人类与疾病的抗争提供了新的方向。

虽然CRISPR/Cas9基因编辑技术仍然面对着很多挑战,如脱靶现象的存在以及现实中存在的伦理问题,都提示我们一定要安全规范的使用这一技术并且应该着重于优化该项技术,使其能够更好的服务于科学研究。