细胞焦亡在自身炎症性疾病发病中的作用

苗俊珂，沈敏

自身炎症性疾病(systemic autoinflammatory diseases，SAIDs)是由于基因突变引起固有免疫异常，进而造成系统性或器官特异性炎症的一组遗传性疾病[1]。固有免疫是机体抵御外来入侵的第一道防线，主要通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)与损伤相关分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)激活下游信号通路发挥作用，其功能的异常或缺陷与SAIDs的发生密切相关[2]。细胞焦亡(pyropto-sis)是近年来逐渐被定义的一种细胞程序性死亡，与凋亡不同，焦亡是一种细胞的炎性死亡，其主要效应是在细胞死亡的同时释放炎性介质从而引发机体炎症反应。作为固有免疫的重要组成部分，焦亡一方面可通过炎症反应清除胞内危险因素起到免疫保护作用，另一方面其过度活化也可导致炎症反应过强而致病。已有研究表明，多种疾病,如感染性疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化及肿瘤的发病过程中均有焦亡参与[3-5]。引起细胞焦亡的主要信号之一为胞内PRR,如核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLR pyrin domain containing 3, NLRP3)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白C4 (NLR containing a caspase recruitment domain 4, NLRC4)与炎素(pyrin)等炎性小体的异常活化，这也是SAIDs重要的发病机制之一。二者共同的上游信号通路提示，焦亡在SAIDs的发病中可能也起重要作用。本文对焦亡在SAIDs发病机制中的作用进行综述。

1 细胞焦亡与炎症

虽然细胞焦亡早已被观察到，但直到2001年这一概念才被正式提出[6]。近年来随着人们对焦孔素(gasdermin)认识的不断加深，焦亡的概念也在不断更新。现普遍认为细胞焦亡是一种由gasdermin蛋白，尤其是焦孔素D(gasdermin D,GSDMD)介导,可有半胱氨酸蛋白酶(caspase)参与的细胞程序性死亡[7-10]，其发生过程主要包括炎性半胱氨酸蛋白酶活化、GSDMD裂解释放以及胞膜成孔破裂等几个方面。

炎性半胱氨酸蛋白酶包括caspase-1/4/5/11，其激活方式包括由活化的炎性小体与caspase-1介导的经典途径以及由细菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)与caspase-4/5/11介导的非经典途径两种。炎性小体为胞内一种多聚蛋白复合物，主要由传感器，适配器以及酶原前体(procaspase-1)三部分组成。在焦亡的经典途径中，活化的炎性小体可促进胞内procaspase-1自身剪切成为有活性的caspase-1，后者一方面可引起促炎因子白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18等的释放，另一方面可引起GSDMD蛋白裂解进而发生焦亡。非经典途径中，caspase-4/5/11可直接识别细菌LPS发生寡聚化，从而裂解GSDMD引发焦亡[8,11-12]。GSDMD的裂解位点位于其氨基端结构域(GSDMD-N)和羧基端结构域(GSDMD-C)相连的部位，正常情况下，GSDMD-N可被GSDMD-C抑制，而焦亡发生时，GSDMD裂解活化使GSDMD-N自GSDMD-C释放，随之发生寡聚化并转位至胞膜上，与胞膜脂蛋白结合介导胞膜成孔，并引起胞内钾离子自小孔外流，细胞内外渗透压差增大，最终使细胞发生肿胀溶解，破裂死亡[7,13-15]。与此同时，胞内各种促炎因子如IL-1β，IL-18也可通过胞膜小孔或破裂的胞膜释放至胞外，不仅放大了原有炎症作用，还可引起全身的炎症反应[16](图1)。

近期研究发现，GSDMD还可通过多种机制促进机体炎症反应发生。一方面，GSDMD可通过非焦亡方式引起IL-1β释放从而发挥类似焦亡的作用，如中性粒细胞中，GSDMD活化裂解后其GSDMD-N并不向移向胞膜成孔而是移向噬天青颗粒及自噬小体，通过自噬作用引起胞膜成孔进而释放IL-1β[17]。肠上皮细胞中caspase-8的活化也可激活GSDMD，通过胞吐的方式引起含有IL-1β小泡的释放，这些炎症介质可作为外源危险因素进一步使机体分泌更多IL-1β[18]。另一方面，GSDMD-C除可发挥抑制GSDMD-N的作用外，还可与caspase-1/4自身加工产生的p10片段相结合，正反馈促进GSDMD裂解，进一步促进焦亡发生[19-20]。此外，作为程序性死亡的一种，焦亡与其余类型的细胞死亡之间也存在紧密联系。多项研究表明，在caspase-1失活或缺失的小鼠中，凋亡相关半胱氨酸蛋白酶caspase-3/8可被激活[7]，进而引起细胞溶解性死亡，该过程可能是由GSDMD相关焦亡被抑制所致。但对其下游的细胞死亡方式现仍存争议，Lee等[21]认为该溶解性死亡为继发于凋亡的细胞坏死，而Schneider等则认为这可能是一种与凋亡和焦亡均不完全相同的炎性死亡[22]。

综上，焦亡可通过不同机制促进炎症发生与细胞死亡，还可与其他细胞死亡方式相互配合，共同维持细胞稳态。

2 细胞焦亡与SAIDs之间的关系

炎性小体病是最为常见的一类SAIDs，其主要发病机制为基因突变引起的炎性小体活化阈值降低或异常持续活化，因此，焦亡与SAIDs存在共同的上游信号通路，在SAIDs发病中焦亡可能起到了重要作用：第一，在某些SAIDs动物模型中，敲除GSDMD相关基因抑制焦亡发生后，炎症得以缓解[23-24]；第二，SAIDs患者体内起致病作用的高水平IL-1β和IL-18可能是经焦亡形成的膜上小孔及破裂胞膜所释放，在GSDMD相关基因敲除的小鼠中IL-1β的成熟虽不受影响但其释放过程受限[8,10]；第三，炎性小体病中抑制IL-1β、IL-18并不能完全缓解炎症，说明细胞尚可通过其死亡引起炎症，该死亡方式与caspase-1相关，很可能就是焦亡[25]。

图 1 焦亡发生过程

但焦亡与SAIDs之间的关系尚未完全确定。首先，不同病因引起炎性小体活化进而发生焦亡的机制有所不同，如大多研究中焦亡由细菌感染诱发，其引起NLRP3炎性小体的活化需经启动与激活两步反应，而SAIDs中焦亡的发生则是由基因突变引起炎性小体活化所致，往往仅需启动反应一步[26]。再如细菌感染活化pyrin炎性小体时需要完整的微管结构参与，而MEFV基因突变后不需微管结构参与即可引起pyrin炎性小体活化[27-28]。其次，如前所述，机体可通过一些与焦亡无关而与GSDMD相关的方式引起IL-1β释放，从而起到类似焦亡的作用[18]，故在SAIDs动物模型中通过敲除GSDMD相关基因研究焦亡的作用时，可能无法确定其实验结果是由于焦亡被抑制引起，还是由于与焦亡无关而与GSDMD相关的IL-1β释放受抑制所致。因此，SAIDs与焦亡的确切关系仍需进一步研究。

3 细胞焦亡在几种常见SAIDs中的作用

3.1 NLRP3炎性小体病

与NLRP3炎性小体相关的SAIDs既包括单基因病冷炎素相关周期综合征(cryopyrin-associated periodic syndrome，CAPS)，又包括多基因病如克罗恩病、痛风等，此部分主要对CAPS与焦亡的关系进行介绍。

CAPS是由NLRP3基因发生功能获得性突变导致NLRP3炎性小体持续活化所引发的一组SAIDs。根据症状不同，CAPS可分为新生儿起病多系统炎症性疾病(neonatal onset multisystem inflammatory disease，NOMID)、Muckle-Wells综合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)以及家族性冷自身炎症综合征(familial cold autoinflammatory syndrome，FCAS)三种类型，其共同的临床症状包括发热、荨麻疹以及中枢神经系统炎症。

与MWS不同， NOMID和FCAS患者仅部分对IL-1拮抗剂有效，提示除IL-1β外还有其余因素参与CAPS的发病[25]。2013年Brydges等[25]在FCAS小鼠模型中发现了一种与caspase-1相关的非凋亡性细胞死亡方式可引起炎症，推测该死亡方式即为细胞焦亡。此外，研究表明蛋白激酶A(PKA)可直接磷酸化NLRP3基因的特定位点使其失活并抑制细胞焦亡，部分NOMID患者由于该特定位点突变从而出现NLRP3异常活化及焦亡发生[29]。一项体内实验通过敲除NOMID小鼠模型中的GSDMD，发现其皮肤病变、脾大、生长受限等症状均有所缓解，肝、皮下组织以及脾等组织中的中性粒细胞浸润也有所减少，进一步证实GSDMD介导的细胞焦亡在NOMID的发病中可起重要作用，GSDMD有望作为NOMID治疗的新靶点[24]。

3.2 Pyrin相关自身炎症性疾病

Pyrin相关自身炎症性疾病(pyrin-associated autoinflammatory disease，PAAD)是一组由MEFV基因突变引起pyrin炎性小体过度活化，进而引发一系列症状的SAIDs，可分为家族性地中海热(familial Mediterranean fever, FMF)、pyrin相关自身炎症性中性粒细胞性皮炎(pyrin-associated autoinflammation with neutrophilic dermatosis，PAAND)、慢性无菌性骨髓炎以及青斑样溃疡性皮炎等多种类型。目前有报道FMF和PAAND的发病与焦亡相关[2]。

FMF是一组常染色体隐性遗传病，主要临床表现包括周期性发热、皮疹、浆膜炎以及关节炎等，其发病主要由MEFV基因突变引起Rho GTPase失活，进而引起pyrin炎性小体活化阈值降低所致，活化后的pyrin炎性小体可引起细胞焦亡发生。研究表明，MEFV等位基因突变的个数与FMF症状的严重程度及外周血中焦亡的严重程度呈正相关，且抑制FMF患者外周血中pyrin炎性小体活化所必需的PKN1、2蛋白后其焦亡的程度也可大大减弱[28]。近年来，Lamkanfi等[30]通过体外实验证明，用梭状芽孢杆菌感染FMF模型小鼠的巨噬细胞可引起焦亡发生，同时伴有IL-1β分泌增加；进一步体内实验发现，敲除该模型小鼠GSDMD基因后IL-1β水平明显下降，炎症缓解，且器官特异性炎性损伤如肝炎、肾小球肾炎、结肠炎等也同样得到缓解。这些研究均表明GSDMD介导的细胞焦亡在FMF的发病中可能起重要作用，GSDMD有望成为治疗FMF的新靶点。

PAAND为一种常染色体隐性遗传病，主要临床表现为幼年起病，反复发作的嗜中性粒细胞性皮炎、周期性发热、关节痛、肌痛或肌炎等。与FMF不同，其发病机制为MEFV基因特定位点功能获得性突变，导致pyrin炎性小体正常抑制状态被破坏而持续活化，进而引起IL-1β和IL-18大量释放以及GSDMD介导的细胞焦亡。PAAND患者外周血单核细胞中可见细胞焦亡水平的增加[27,31-33]，焦亡介导的胞膜成孔及胞内DAMP释放可引起皮肤等局部组织中大量细胞因子的产生与聚集，最终引起PAAND患者的嗜中性皮病与炎症[33]。

3.3 NLRC4炎性小体病

NLRC4相关炎性小体病主要包括三种：自身炎症伴婴幼儿小肠结肠炎(autoinflammation with infantile enterocolitis，AIFEC)，NOMID(部分)和FCAS4。其中仅AIFEC有报道可能与焦亡相关[34-35]。

AIFEC是2014年新发现的一种由NLRC4基因HD1结构域发生功能获得性突变导致NLRC4炎性小体异常活化所引起的SAID，主要表现为周期性发热、分泌性腹泻、新生儿结肠炎及巨噬细胞活化综合征。AIFEC患者外周血中可见焦亡增多的现象[36-37]。2018年Moghaddas等[38]研究发现NLRC4基因亮氨酸富集结构域(LRR)发生突变也可引起与AIFEC相似的症状，但LRR结构域突变引起细胞焦亡的过程并不依赖凋亡斑点蛋白参与，表明该位点突变引起的细胞焦亡可能并非位于NLRC4炎性小体下游，而是与NLRC4炎性小体的活化并列位于caspase-1下游。

3.4 多基因SAIDs

多基因SAIDs的发病机制较为复杂，常由遗传、免疫与环境等多种因素共同作用引起，常见疾病包括成人Still 病、白塞病、克罗恩病(Crohn’ s disease，CD)、痛风等。现有研究提示焦亡可能与CD及痛风的发病有关。

CD以腹痛、腹泻等消化道症状为主要临床表现，与NOD2基因相关。早有研究发现CD患者肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)和巨噬细胞中焦亡相关蛋白如caspase-1的p20片段、NLRP3、GSDMD等表达水平增高，提示这两种细胞的焦亡可能与CD肠黏膜屏障功能破坏及炎症密切相关[39-40]。

尽管IEC可通过细胞焦亡清除部分被病原体感染的细胞，但其主要作用仍为破坏黏膜屏障从而导致炎症发生[41]。一项由100位CD患者参与的多中心队列研究发现，回肠IEC中焦亡的严重程度可作为一种潜在的生物标记用以判断疾病活动度，预测抗干扰素药物维度丽珠单抗(vedolizumab)对CD的治疗效果，甚至还可用于指导生物制剂选择[42]。细胞有丝分裂相关酶(NIMA-related kinase 7，NEK7)为NLRP3炎性小体活化所必须的酶[43]，Chen等[39]通过体外实验发现，IEC中NLRP3活化后可与NEK7相互作用促进IEC发生焦亡，这在CD的发病中起重要作用。进一步体内实验发现，敲除结肠炎小鼠中NEK7基因，焦亡相关蛋白的表达水平有所下降，且其肠道的炎症症状及全身炎症症状均有所缓解。

在与CD发病相关的巨噬细胞中，细胞焦亡也可起到促炎作用。最近一项研究表明，CD患者肠黏膜受损后，巨噬细胞可释放胞核蛋白剪接体相关蛋白130(spliceosome-associated protein 130，SAP130)作为一种DAMP激活C型凝集素-脾酪氨酸激酶(Mincle-Syk)信号通路，活化其下游的NLRP3/caspase-1，进而促进GSDMD裂解和焦亡发生，同时释放大量IL-1β和IL-18等炎性细胞因子[40]。然而另有研究表明，虽然与IEC相比，巨噬细胞胞内GSDMD较少，且其介导的细胞焦亡主要起促炎作用，但GSDMD本身对于肠道炎症也可起保护作用。在结肠炎模型小鼠中，GSDMD可通过抑制环磷酸鸟苷-腺苷合成酶-干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)信号通路减轻肠道炎症症状，这一过程与肠道菌群无关，主要是由GSDMD在胞膜成孔引起大量钾离子排出所致[44]。总之，虽然巨噬细胞焦亡主要起促炎作用，但其胞内的GSDMD可能同时具有促炎和抑炎的双重作用。

痛风是由单钠尿酸盐(mono-sodimu urate，MSU)晶体沉积在关节及其周围组织进而引起全身炎症反应的一种多基因SAID。虽然早有研究表明MSU引起炎症的发生与NLRP3炎性小体的活化密切相关[45-46]，但对细胞焦亡在痛风发病中所起的作用现仍存争议[47]。一项体外实验发现，MSU晶体可迅速引起小鼠巨噬细胞中GSDMD表达水平增高，这为痛风患者体内存在焦亡的过度发生提供了证据。而进一步体内实验发现，在敲除GSDMD，caspase-1或MLKL(细胞坏死的主要介质)相关基因的小鼠中，MSU晶体引起的细胞死亡并未发生明显改变，体内IL-1β的水平也无明显下降，同时利用胞外高钾抑制NLRP3炎性小体活化后，细胞死亡的发生也未受明显影响，这些均提示MSU引起的细胞死亡是一种与凋亡、焦亡和坏死均不相同的细胞死亡方式[48]。然而Li等[49]则认为焦亡在痛风的发生中可起重要作用。嘌呤的鸟苷酸受体P2Y14R对NLRP3炎性小体起负向调控作用，在敲除P2Y14R相关基因的小鼠中可见NLRP3表达水平下降，MSU相关焦亡减少且痛风症状缓解。总之，焦亡在痛风发病中的作用尚存争议，GSDMD能否成为治疗痛风的靶点仍需进一步探究。

综上，SAIDs与细胞焦亡之间存在密切联系，二者相互作用、相互影响。虽然焦亡在多种SAIDs患者的外周血中均已被观察到，且已有大量实验证明SAIDs与细胞焦亡存在共同的上游信号通路及调节因素，但至今为止，仅有NOMID与FMF两种动物模型通过体内实验确定了GSDMD及其介导的焦亡在SAIDs发病中的作用(表1)。总之，焦亡在SAIDs发病中可能起到一定的作用，但具体机制尚未完全明确，对于焦亡的进一步研究有望为发现SAIDs治疗的新靶点提供可能。

表1 焦亡在几种SAIDs发病机制中的可能作用Table 1 Potential roles of pyroptosis in the pathogenesis of SAIDs