主动脉瓣膜钙化中胰高血糖素样肽-1对Notch1-Sox9信号通路的调控作用

查晴 肖凡 张倩茹 叶佳雯 张煜 杨玲 杨克 刘艳

钙化性瓣膜疾病是导致主动脉瓣膜功能失调的常见原因，其主要临床表现有运动后呼吸困难、心律失常、昏厥、心绞痛等[1-5]。在钙化性瓣膜疾病进展过程中，间质细胞作为主动脉瓣膜中主要细胞，参与胞外基质合成和钙化[6]。研究表明，主动脉瓣膜间质细胞过表达Sox9可减缓钙化进程，而Notch通路对Sox9激活起调控作用。当敲除Notch1与Sox9相结合的结构域后，Notch胞内结构域(NICD)对Sox9转录活性的调控作用大幅削减。因此，抑制Notch信号通路可下调Sox9表达，促使主动脉瓣膜间质细胞钙化[7-9]。本课题组前期研究发现，Sox9作为转录激活因子，通过直接或间接作用与其他信号通路协同参与软骨分化形成过程。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是胰高血糖素降解产物[10]。GLP-1通过结合其特异性GLP-1受体(GLP-1R)抑制胰高血糖素分泌，刺激胰岛素和促生长素抑制素分泌，从而缓解胰岛素抵抗[11-12]。而GLP-1R激动剂如艾塞那肽、利拉鲁肽、利西拉来等除具有降糖作用，还可减轻体质量，降低血压，改善血脂，减少心血管事件，提高生存率[13-16]。GLP-1R活化还可通过激活多种激酶降低心肌缺血性损伤，抑制局部缺血后重构。本研究探讨在主动脉瓣膜钙化过程中，GLP-1及其受体对于Notch1-Sox9信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM∶F12培养基 ( 1∶1，低糖含20%胎牛血清)、低糖培养基 (含10%胎牛血清)、成骨诱导分化培养基均购自GIBCO公司。免疫组织化学染色试剂盒、BCA试剂盒均购自迈新公司；Sox9、GLP-1R、NICD和β-actin一抗均购自Abcam公司，免疫荧光检测二抗购自CST公司；水性封片剂(含DAPI)购自Invitrogen公司；SYBR Green Real-time PCR试剂盒购自Takara公司。C57BL/6小鼠购自上海斯莱克公司。

1.2 主动脉瓣钙化组织收集

纳入2016年6月至2017年5月于上海瑞金医院心外科和上海市第九人民医院心外科就诊的36例患者，其中16例为主动脉瓣病变患者，排除风湿性心脏病、先天性心脏病及炎症性疾病，行外科主动脉瓣置换手术，设为瓣膜钙化组；20例为因病情进行心脏移植，但瓣膜组织无退行性病变的患者，设为对照组。于病案室收集患者基本信息，外科手术时收集患者主动脉瓣膜组织。本研究经伦理委员会审批同意，所有患者均签署书面知情同意书。

1.3 主动脉瓣膜组织苏木精-伊红染色、茜素红染色及免疫组织化学染色

外科手术时获得瓣膜钙化组和对照组主动脉瓣膜组织，即刻使用4%福尔马林液固定24 h，石蜡包埋，以5 μm厚度连续切片。

苏木精-伊红染色(HE染色)：切片放入苏木精水溶液中染色5～10 min；置于醋酸及氨水中各5 s；冲洗脱水后放入伊红染色液中染色2～3 min；脱水固定后树脂封片，显微镜下观察。

茜素红染色：切片放入茜素红染色液中10 min，冲洗脱水固定后，树脂封片，显微镜下观察。

GLP-1R免疫组织化学检测：切片进行抗原修复，5%马血清封闭30 min，滴加1∶100稀释的抗GLP-1R抗体，4 ℃过夜，加入1∶250稀释的二抗孵育30 min，冲洗二抗。DAB法显色，复染苏木精，脱水固定后，树脂封片，显微镜下观察。

1.4 主动脉瓣膜间质细胞原代培养

取4周龄C57BL/6小鼠，完整分离出主动脉瓣膜，在无菌条件下，将主动脉瓣膜剪为0.5 mm×0.5 mm大小组织块，使用200 μL的胎牛血清重悬组织块，将该组织块悬液均匀涂布于细胞培养皿表面，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，1 h后取出。加入DMEM∶F12培养基，继续放置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，细胞生长至融合状态后进行传代。

1.5 主动脉瓣膜间质细胞钙化诱导培养及GLP-1处理

待原代培养的小鼠主动脉瓣膜间质细胞生长至细胞融合时，将细胞分为3组，正常培养组以含10%胎牛血清的低糖培养基培养7 d，钙化培养组使用钙化诱导培养基培养7 d诱导钙化，钙化培养+GLP-1组在钙化诱导培养同时加入终浓度为100 pmol/L的GLP-1处理7 d。

1.6 主动脉瓣膜间质细胞茜素红染色及免疫荧光检测

培养小鼠原代主动脉瓣膜间质细胞并转移至细胞爬片，4%多聚甲醛37 ℃固定20 min。加入茜素红染色液染色，观察细胞钙化情况。

细胞爬片经4%多聚甲醛固定后，加入0.2%Triton室温放置2 min，5%的马血清4 ℃封闭1 h，加入抗Sox9、NICD抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜。加入相应二抗(1∶400)，室温孵育1 h。DAPI染色封片，共聚焦显微镜下观察拍照。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

TRIzol裂解液提取钙化培养组及正常培养组细胞RNA，逆转录合成cDNA，根据试验盒说明书行qRT-PCR。Sox9上游引物5′-AGGTGCTCAAAGGCTACGACTG-3′，下游引物5′-CGCGGCTGGTACTTGTAATCC-3′；β-actin上游引物5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算Sox9 mRNA的相对表达水平，每次实验重复3次。

1.8 Western blot检测

蛋白裂解液提取正常培养组、钙化培养组及钙化培养+GLP-1组蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗GLP-1R、SOX9、NICD、β-actin抗体 (1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶 (HRP)标记的二抗 (1∶5 000)，室温孵育2 h后加入ECL工作液显影，ImageJ分析软件对图像的灰度值进行定量，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达水平。每次实验重复3次。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以平均值±标准差表示，数据呈正态分布且方差齐时，组间采用非配对t检验，如数据不符合正态分布则使用秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GLP-1R在人主动脉瓣膜钙化组织中的定位及表达

对人主动脉瓣组织进行染色分析，HE染色示瓣膜钙化组瓣膜厚度大于对照组。茜素红染色结果显示对照组无红色钙化染色区域，而瓣膜钙化组组织中心区域呈强阳性红色染色，提示钙化。免疫组织化学染色显示，对照组中GLP-1R表达于瓣膜间质细胞中，并呈阳性表达(棕色染色)，瓣膜钙化组中虽有GLP-1R表达但较对照组呈弱表达，见图1。

图1 2组人主动脉瓣膜组织中钙化情况及GLP-1R表达情况

2.2 钙化培养下GLP-1对原代瓣膜间质细胞中GLP-1R表达的影响

分组培养小鼠主动脉瓣膜间质细胞，普通光学显微镜下观察发现，正常培养组呈纤维样细胞生长，表现为细胞形态狭长并呈放射状生长。钙化培养组细胞形态发生变化，表现为细胞变大，细胞核清晰但细胞轮廓边缘不清，钙化培养+GLP-1培养组细胞形态恢复狭长呈放射状生长。

茜素红染色后，钙化培养组瓣膜间质细胞呈红色染色，钙化培养+GLP-1组较钙化培养组红色染色明显减弱。见图2。

图2 3组小鼠主动脉瓣膜间质细胞形态及钙化情况

Western blot检测示钙化培养组GLP-1R的蛋白表达水平明显低于正常培养组(0.87±0.65对2.54±1.81，P=0.041)，但钙化培养+GLP-1组GLP-1R的蛋白表达水平明显高于钙化培养组(2.38±1.36对0.87±0.65，P=0.021)，见图3。

图3 3组小鼠主动脉瓣膜间质细胞GLP-1R的蛋白表达情况

2.3 GLP-1对主动脉瓣膜间质细胞Sox9表达的影响

钙化培养+GLP-1组Sox9的mRNA表达水平(2.14±0.21对1.01±0.01，P<0.01)、蛋白表达水平(3.21±0.93对0.49±0.15，P<0.01)均明显高于钙化培养组，见图4A。免疫荧光染色显示，钙化培养+GLP-1组Sox9的蛋白表达水平明显强于钙化培养组，见图4B。

注：A为Western blot检测主动脉瓣膜间质细胞Sox9的蛋白表达水平；B为免疫荧光染色检测主动脉瓣膜间质细胞Sox9的表达和定位(×200)

2.4 GLP-1对主动脉瓣膜间质细胞NICD入核的影响

钙化培养组NICD入核量低于正常培养组。与正常培养组和钙化培养组相比，钙化培养+GLP-1组NICD入核量增加，见图5。

注：DAPI发蓝色荧光，显示细胞核；NICD为红光荧光

2.5 GLP-1对主动脉瓣膜间质细胞NICD表达的影响

与正常培养组相比，钙化培养组中NICD蛋白表达水平明显下降(0.41±0.15对0.87±0.15，P<0.05)。与钙化培养组相比，钙化培养+GLP-1组NICD蛋白表达水平明显升高(0.94±0.26对0.41±0.15，P<0.05)。见图6。

图6 3组小鼠主动脉瓣膜间质细胞NICD蛋白表达情况

3 讨论

研究表明，GLP-1等胰岛素受体增敏剂干预阿尔兹海默症后，可有效提高患者的认知能力并改善脑内病变程度[17]。GLP-1可直接通过血脑屏障进入中枢神经系统并与脑内分布的GLP-1R结合，参与对胰岛素信号下游通路的调节，发挥神经保护作用，主要为减少凋亡、抑制β样淀粉酶(Aβ)损伤作用，并减少Tau蛋白异常过度磷酸化[18]。而这些生物学效应均涉及细胞的退行性病变过程。在同属于退行性病变范畴的钙化性主动脉瓣膜疾病中，GLP-1的作用尚不可知。本研究发现，钙化的主动脉瓣膜GLP-1R的表达水平低于正常瓣膜组织。GLP-1可抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化，这提示在主动脉瓣膜钙化这一退行性病变中，GLP-1可能具有对抗钙化的作用。在体外实验中，用钙化培养基诱导细胞钙化，结果显示钙化处理后的细胞GLP-1R表达水平下降。

钙化的形成是复杂而精密的细胞分子过程，Sox9的功能异常是导致主动脉瓣膜钙化的主要原因[4,19-20]。为进一步分析GLP-1R在钙化过程中的作用，本研究使用GLP-1刺激小鼠原代瓣膜间质细胞，结果显示GLP-1能够上调Sox9的表达，提示GLP-1可能通过Sox9调控细胞钙化。GLP-1调控Sox9的机制目前尚不清楚，有研究表明，组织钙化区域Notch1表达水平下降，可下调下游转录因子Sox9的表达[21-23]。Notch在水解后生成Notch活性片段NICD，NICD进入核内，调控核内相关基因转录[24]。上游分子可通过改变NICD的水平和NICD入核，调控下游Sox9的表达[25]。本研究证明GLP-1可诱导钙化瓣膜间质细胞中的NICD表达，使NICD入核增加，同时增加瓣膜间质细胞中Sox9表达水平。因此，GLP-1可能通过其受体GLP-1R调控Notch-1活性片段NICD及Sox9的升高，从而抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化进展。

综上所述，在主动脉瓣膜钙化病变过程中，GLP-1R水平的下降使GLP-1的抗瓣膜钙化作用减弱，而GLP-1则可通过其受体GLP-1R调控下游NICD表达及入核，进而调控抗钙化基因Sox9的表达，发挥抗瓣膜钙化作用。GLP-1有望成为潜在的预防和治疗主动脉瓣膜钙化的药物。