过表达c-Ski改善心房颤动犬模型心房电重构和结构重构

韩素霞 王娟 高苏莉 盛乐智 李耀

心房颤动(AF)可引起心房重构。AF与心房结构的进行性改变有关[1-3]；心房间质纤维化、成纤维细胞变性和细胞外基质(ECM)的合成破坏了心房肌细胞间的电生理连接，引起电传导紊乱[4]。c-Ski是v-Ski癌蛋白的同源蛋白，在包括心脏组织在内的不同组织中广泛表达[5]。沉默c-Ski可增强转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的心肌细胞H9C2上皮间质转化[6]。微小RNA(miRNA)-34a/miR-93/c-Ski轴调节TGF-β1和异丙肾上腺素(ISO)诱导的心脏纤维化[7]。前期研究证实，c-Ski抑制TGF-β1诱导的人心脏成纤维细胞和ECM合成[8]，提示c-Ski在心脏纤维化中发挥作用，但c-Ski在AF心房重构中的作用尚未报道。本研究在心房起搏犬模型中转染c-Ski过表达腺病毒载体，分析c-Ski对犬心房起搏诱导的心房重构的影响。

1 材料与方法

1.1 AF犬模型构建及分组

对比格犬行超声心动图后构建AF模型。将起搏器固定在比格犬的背部，并通过颈外静脉连接到右心房的起搏导线上，连续4周以400次/min的速度进行右心房起搏。心电图显示P波消失、基线消失、RR间期绝对不等则提示AF模型构建成功。停心房起搏1周，以确保F波基线状态稳定。开胸后暴露心脏，剪开心包，将其4角吊起，固定胸壁，建立心包支架，将腺病毒注射到右心房的多个部位后缝合，2周后处死动物。

18只10～12 kg的比格犬随机分成4组：假手术组(仅植入起搏器，但不起搏，n=3)、AF对照组(仅构建AF模型，n=3)、AF-AdNull组(在AF模型中转染腺病毒空载体，n=6)和AF-Adc-Ski组(在AF模型中转染c-Ski过表达腺病毒载体，n=6)。过表达c-Ski的腺病毒载体和对照室载体购自汉恒生物科技有限公司。本研究的动物实验经过上海卫生大学附属上海浦东新区人民医院实验动物管理委员会批准。

1.2 电生理实验

电生理实验室系统在基本起搏周期为300 ms时测定AF模型中起搏器的诱导能力和持续时间。诱导成功的AF定义为心房程序性刺激后心电图上P波消失和心房快速活化，心室反应不规则。对各部位心肌尝试3次起搏器诱导AF，同时记录起搏器诱导AF的持续时间。AF诱导率=诱导AF成功次数/总诱导次数。

1.3 苏木精-伊红染色检测心房组织变化

取犬心房组织，在4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片厚度为5 μm。二甲苯脱蜡，酒精浓度从高到低进行梯度水化，苏木精染色和伊红染色，梯度脱水，透明和封片。在显微镜下观察各组心房组织情况。

1.4 Masson染色检测心肌纤维化

将犬心房组织石蜡切片脱蜡至水，Masson复合染色液染色，洗去残余染液。磷钼酸溶液染色后加入苯胺蓝染液复染，分化液分化且重复2次。酒精梯度脱水，二甲苯透明后中性树脂封片。在显微镜下观察各组心肌纤维化情况。

1.5 苦味酸-天狼星红染色检测胶原纤维

将犬心房组织石蜡切片脱蜡至水，天青石蓝染液染色5 min，天狼猩红-饱和苦味酸染液浸染后，无水乙醇分化，梯度脱水，二甲苯透明后中性树脂封片。在显微镜下观察各组胶原纤维情况。

1.6 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测c-Ski的mRNA表达水平

用TRIzol试剂(Takara公司)从犬心房组织中提取RNA。采用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara)合成cDNA，采用SYBR预混合Ex TaqⅡ试剂盒(Takara)在MX3005 real-time PCR仪上进行qRT-PCR。每组重复3次，以GAPDH为对照，以2-ΔΔCt法测定c-Ski的mRNA表达水平。

1.7 Western blot法检测蛋白表达水平

将犬心房组织在裂解液中匀浆，离心纯化，分离出总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒(碧云天公司)测定蛋白浓度。电泳分离可溶性蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%牛奶封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。采用红外成像系统扫描仪和ImageJ软件对目的条带进行分析。

1.8 统计学分析

数据以均数±标准差表示。统计学分析均采用GraphPad Prism 5.0软件。两组间比较采用Student′st检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组电生理学指标比较

采用电生理方法测定快速起搏构建的AF犬模型的AF诱发率和持续时间。实验6周后，AF对照组和AF-AdNull组AF诱导率和持续时间明显高于假手术组，而AF-Adc-Ski组诱导率和持续时间明显低于AF对照组和AF-AdNull组。见表1。

表1 各组AF诱导率和持续时间比较

2.2 各组心房病理学特征及c-Ski表达水平比较

HE染色示，假手术组的心房肌细胞间隙适中，纤维排列整齐有序；AF对照组和AF-AdNull组的心肌间质细胞增生，排列不整齐，大小不规则；AF-Adc-Ski组的心肌间质纤维增生、排列不整齐和大小不规则的情况较AF对照组和AF-AdNull组改善。见图1。

图1 各组心房组织苏木精-伊红染色情况

qRT-PCR和Western blot检测结果表明，AF对照组和AF-AdNull组犬心房组织c-Ski的mRNA和蛋白表达水平均明显低于假手术组，而AF-Adc-Ski组犬心房组织中c-Ski的mRNA和蛋白表达水平均明显高于AF对照组和AF-AdNull组(P均<0.05)，见表2、图2。

表2 各组心房组织c-Ski的mRNA和蛋白表达水平比较

图2 各组心房组织c-Ski蛋白表达情况

2.3 各组心房纤维化情况比较

Masson染色和苦味酸-天狼星红染色结果显示，假手术组仅有极少量心肌间质纤维化，未见纤维组织增生，仅有极少量胶原纤维。AF对照组和AF-AdNull组胶原排列成疏网状，Ⅲ型胶原比例增加，间质纤维化，且较假手术组更为广泛；而AF-Adc-Ski组心房组织间质纤维化较AF对照组和AF-AdNull组明显减轻，见图3、表3。

图3 各组心房组织Masson染色、苦味酸-天狼星红染色情况

Western blot结果显示，AF对照组和AF-AdNull组心房组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)的蛋白表达水平明显高于假手术组，AF-Adc-Ski组心房组织中α-SMA和collagenⅢ的蛋白表达水平明显低于AF对照组和AF-AdNull组。见表3、图4。

表3 各组胶原蛋白比例及α-SMA、collagenⅢ的蛋白表达水平比较

图4 各组心房组织α-SMA 和 collagenⅢ蛋白表达情况

3 讨论

AF的发生和维持与心房重构密切相关[9]。心房纤维化改变心房电传导和兴奋性，为AF的维持提供基础。Nakashima等[10]发现心房起搏犬在心脏起搏2周后，心房已经进入一种无序的紊乱颤动状态，心房内传导次数和房颤持续时间增加，起搏4周后继续增加。本研究构建了AF犬模型，电生理实验结果显示，过表达c-Ski可以明显降低快速起搏后AF的诱发率和持续时间。Zhao等[11]结果显示，快速起搏心房2周后，心房出现纤维化，纤维化改变是使AF进展的基本因素，心房纤维化与重构协同作用导致AF。本研究通过苏木精-伊红染色、Masson染色和苦味酸-天狼星红染色证明过表达c-Ski可以明显改善快速起搏诱导的心房纤维化。心肌纤维形成的主要特征是ECM的积累和沉积，尤其是胶原蛋白的积累和沉积，ECM蛋白水平的升高可能与AF的发病密切相关[12]。为了评估c-Ski参与心房结构重构的程度，本研究采用组织病理学和Western blot方法检测犬心房纤维化程度以及纤维化相关因子α-SMA和collagenⅢ的表达水平。正常心脏的胶原蛋白主要受心脏成纤维细胞调节。心脏纤维化的特征是胶原、α-SMA、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等过度沉积在心脏ECM中，导致心脏收缩期和舒张期功能障碍。本研究结果显示，过表达c-Ski能够明显抑制心房起搏犬α-SMA和collagenⅢ的蛋白表达水平，提示c-Ski可能在AF相关的心房重构中发挥重要作用，是治疗纤维化的潜在靶点。本研究在快速心房起搏诱导的AF犬模型中发现c-Ski表达下调，过表达c-Ski可降低快速起搏后AF的诱发率和持续时间。另外，组织染色显示c-Ski明显改善快速起搏诱导的心房纤维化。过表达c-Ski抑制快速心房起搏诱导的AF犬中α-SMA和collagenⅢ的表达水平升高。上述结果提示c-Ski可能在AF引起的纤维化中发挥作用，是潜在的治疗纤维化的靶点。