RhoA/ROCK2通路在心脏成纤维细胞分化中的作用机制

廖荣恒 祁禛 汪永义

心脏纤维化是一种以肌成纤维细胞过度分泌与细胞外基质过度沉积为特点的病理过程，急性心肌梗死(AMI)后，心脏成纤维细胞在以转化生长因子-β1(TGF-β1)为主的细胞因子作用下分化为肌成纤维细胞，并分泌大量细胞外基质(ECM)，使心脏顺应性下降，影响心脏正常功能[1-2]。心脏成纤维细胞分泌的细胞外基质是维持正常心脏结构必不可少的成分，但分化的肌成纤维细胞分泌细胞外基质的能力大大提升，从而导致心脏纤维化[3-4]。细胞外基质的特异性构成组分是α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)[5]，常作为评价细胞外基质生成的标准。其次，心脏成纤维细胞分化的特征还包括细胞增殖和迁移能力增强[6]。

RhoA/ROCK通路由Rho家族小G蛋白最具代表性的亚型RhoA及其下游分子Rho相关激酶(ROCK)构成，广泛参与如转录调节、迁移、黏附、增殖、细胞生存与凋亡等细胞基本功能的调控[7]。ROCK家族包括2种亚型，即ROCK1与ROCK2，两者具有高度同源性[8]。作为调节细胞行为的重要信号通路，RhoA和ROCK1广泛参与血管平滑肌增生、心肌肥厚和心肌纤维化等过程[9-11]。本研究拟探究RhoA/ROCK2通路在AMI后心脏成纤维细胞分化过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和转染

人心脏成纤维细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。实验处理前，成纤维细胞在无血清DMEM/F12中饥饿6 h,然后用含10 ng/L TGF-β1带血清DMEM/F-12培养基培养。RhoA 小干扰RNA通过Lipo3000在无血清DMEM/F-12培养基中转染8 h，之后换成用含10 ng/L TGF-β1带血清DMEM/F-12培养基继续培养。

1.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

收集细胞后于常温下用lysis buffer裂解15 min，收集裂解液后通过EZ-press RNA提取试剂盒(EZ-bioscience)提取总RNA并确定样本浓度,之后通过HiScript Ⅱ 逆转录试剂盒(Vazyme)合成为cDNA。qRT-PCR采用ChamQ SYBR 绿色荧光染料(Vazyme)与引物混合后在荧光定量热循环仪中进行反应。

1.3 免疫印迹分析(Western blot)

收集细胞后通过RIPA在4 ℃条件下对细胞样本进行裂解，收集裂解液后15 000 g离心15 min取上清液。测定蛋白质样本浓度通过BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime)进行。等量的蛋白样本通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜(PVDF膜)上，室温条件下在5%牛血清白蛋白(Thermofisher)中封闭2 h。封闭结束的PVDF膜在4 ℃条件下用对应的一抗孵育过夜，并在室温条件下用TBST清洗3次。之后在与一抗相同种属的二抗(Beyotime)中孵育1 h，TBST洗3遍后采用增强化学发光试剂(Vazyme)显影，并采用ImageJ 软件处理图像数据。

1.4 划痕实验

细胞种植于六孔板生长至90%密度后，用200 μL枪头在划痕尺的引导下于，每孔左、中、右分别划1道划痕。用PBS洗涤3次后，细胞在不同的处理组中继续培养。相应时间内，六孔板在倒置相差显微镜下通过明场观察并测量划痕宽度变化(放大倍数100倍)。

1.5 Transwell试验

细胞经过不同组的处理后，将等量的细胞悬浮于1.5 mL无血清培养基中种植于Transwell板(Corning)上腔，在下腔中放入2 mL含25%血清的培养基。经过24 h的培养后，迁移至腔底的细胞被固定在4%的甲醛中,用结晶紫(Beyotime)染色后，在光学显微镜下(放大倍数100倍)随机选取5个明场视野计数发生迁移的细胞数。

1.6 小鼠心肌梗死后纤维化模型建立与免疫组织化学染色

将12只6～8周健康雄性C57小鼠随机分为2组，每组6只。假手术组于异氟烷麻醉后切开气管，直视下插管机械通气。AMI组经左胸切口进胸后，寻找小鼠冠状动脉左前降支，结扎相同位置左前降支，保证梗死面积约60%。术后于SPF环境中饲养21 d，处死后取出小鼠心脏，结扎点以下石蜡包埋切片，予以对应抗体染色后，树脂封片于显微镜下明场观察。

1.7 统计学分析

所有数据均采用Graphpad 7.0软件进行作图及统计学分析。两组样本之间比较采用Student′st检验，多组(n≥3)样本之间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoA、ROCK2在梗死心脏组织中表达水平增加

小鼠心脏组织切片中，AMI组梗死区与假手术组相比，RhoA与ROCK2的表达均明显增加(图1)，心脏组织匀浆中，AMI组较假手术组α-SMA、RhoA和ROCK2的mRNA和蛋白表达水平均明显增加(表1)。

表1 2组小鼠心脏组织RhoA、ROCK2、α-SMA表达水平比较(n=6)

图1 假手术组与AMI 组心脏组织RhoA与ROCK2蛋白表达

2.2 RhoA与ROCK2在TGF-β1刺激下分化的成纤维细胞中表达增加

TGF-β1刺激成纤维细胞，α-SMA表达随时间梯度逐渐增加。4个时间点中，RhoA与ROCK2的mRNA与蛋白层表达水平在48 h之前随时间梯度增加，而48 h时表达水平相对24 h时下降(见表2)。

表2 TGF-β1刺激后成纤维细胞中RhoA、ROCK2、α-SMA的表达水平(n=3)

2.3 TGF-β1刺激下分化的成纤维细胞迁移能力增加

TGF-β1刺激成纤维细胞后进行划痕试验与Transwell实验，细胞划痕愈合比例与穿膜数量在24 h之前随时间而增加(见表3)，细胞迁移能力增加，且细胞迁移能力与RhoA、ROCK2变化情况一致。

表3 成纤维细胞划痕愈合比例与穿膜数量(n=3)

2.4 TGF-β1通过RhoA/ROCK2通路增强细胞迁移以促进成纤维细胞分化

利用RhoA小干扰RNA敲低RhoA表达后，相对于TGF-β1+空白小干扰RNA组，TGF-β1+RhoA小干扰RNA组α-SMA、RhoA与ROCK2蛋白表达水平均下降，而空载小干扰RNA不影响实验结果(见表4)。对同样处理的细胞进行划痕实验与Transwell实验，相对于TGF-β1+空白干扰RNA组，TGF-β1+RhoA小干扰RNA组成纤维细胞划痕愈合比例与穿膜量均明显下降(见表5)。

表4 各组成纤维细胞中α-SMA、RhoA、ROCK2蛋白的表达水平比较(n=3)

表5 各组成纤维细胞划痕愈合比例与穿膜数量比较(n=3)

3 讨论

心脏成纤维细胞是心脏中最重要的细胞成分之一，在心脏的结构维持中起着至关重要的作用[12]。心肌梗死后TGF-β1表达增加，引起心脏成纤维细胞过度激活，造成ECM过度沉积，导致心功能障碍和心力衰竭[13-15]。现有治疗心脏纤维化的药物由于不良反应和未知风险在临床上的应用受到限制。因此，探索心脏纤维化下游机制成为解决这个问题的重要方向。本研究结果提示RhoA/ROCK2通路参与心脏纤维化的过程，其相关抑制治疗可能是预防和治疗心脏纤维化的一个新的潜在方向。

RhoA/ROCK1通路作为典型的细胞迁移信号通路，广泛参与细胞骨架形成、细胞极化、迁移过程[16]。作为与ROCK1同源的ROCK2蛋白，其在心脏成纤维细胞迁移过程中的作用尚不清楚。在肿瘤治疗领域，针对RhoA/ROCK通路的治疗策略已见文献报道[17]，临床应用具有一定前景。因此，研究RhoA/ROCK通路参与心脏成纤维细胞分化的机制具有一定的临床价值。

本研究通过构建小鼠AMI后纤维化模型和人成纤维细胞系分化模型明确了RhoA、ROCK2在小鼠心脏梗死后纤维化区域和分化的心脏成纤维细胞中表达增加。通过构建小干扰RNA敲低RhoA蛋白表达，进一步明确了RhoA/ROCK2通路与心脏成纤维细胞迁移的关系。本研究结果证实RhoA/ROCK2通路可通过增强细胞迁移能力促进心脏成纤维细胞分化，在TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞分化过程中，RhoA/ROCK2通路通过增强细胞迁移能力，促进心脏成纤维细胞分化，从而促进AMI后心脏纤维化过程。本研究为通过干扰RhoA/ROCK2通路改善心肌梗死后心脏纤维化过程提供了理论依据。