可测量残留病与儿童急性髓系白血病治疗反应与预后的关系研究进展

霍 娅 综述，于 洁 审校

(重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400013)

急性髓系白血病(AML)是一种侵袭性极强的血液系统恶性肿瘤性疾病，其特征是骨髓中未成熟的髓系前体细胞不受控制的增殖，导致造血功能损伤及骨髓衰竭，占儿童急性白血病的20.00%～25.00%。在AML治疗反应的评估中光学显微镜下形态学完全缓解(CR，三系造血恢复，骨髓原始细胞小于5.00%)被认为是预测AML患者预后的一个重要因素，但有研究发现，即使获得形态学CR的患者仍有相当部分最终复发，表明以形态学作为评估AML患者预后的指标具有局限性。更重要的是，AML具有明确的遗传学及免疫表型的异质性，单纯细胞遗传学异常及基因突变不能完全预测患者预后，迫切需要一个能更好地评估治疗反应、实现个体化治疗的生物学标志物。

可测量残留病(MRD)在20世纪90年代初首次被提出，是指AML患者经化疗或骨髓移植治疗后在形态学CR测定的阈值以下检测到持续存在的白血病细胞群。可用于监测AML细胞对治疗的反应及早期预测分子复发，目前，已被用于急性淋巴细胞白血病及急性早幼粒细胞白血病的治疗标准制定与预后评估，同时，越来越多的血液学专家研究分析了MRD作为成人及儿童AML预后的生物学标志物的应用价值[1]，结果表明，相较于形态学评估，MRD能更精确地评估治疗反应，通过结合传统的风险分层方法能帮助制定更加个性化的缓解后治疗策略，而非既往“一刀切”的治疗方式，从而明显降低复发的风险，提高远期总生存率(OS)。由此可见，MRD有望成为一个独立的、有力的儿童AML的预后预测指标[2-3]。

1 MRD检测方法

MRD检测原理是通过检测在白血病发生、发展过程中出现的基因及免疫表型改变，从而区分正常细胞与白血病细胞。但AML的遗传异质性为MRD检测的临床应用带来了严峻的考验，目前尚无统一的检测方法，主要通过多参数流式细胞术(MFC)、定时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、二代测序(NGS)等进行MRD检测。

1.1MFC MFC主要基于2种部分重叠的手段进行MRD检测：(1)通过检测诊断时确定的白血病相关免疫表型(LAIPs)识别白血病细胞和正常细胞；(2)基于识别供MRD检测的标本中与健康者不同的任何免疫表型(DFN)[4]。其中LAIPs主要包括4种类型，即抗原交叉表达、抗原异步表达、抗原过表达及缺失表达。基于LAIPs的MFC-MRD检测方法主要使用多参数单克隆抗体板，在儿童AML患者中适用范围广泛(>90.00%)，但现有研究表明，在AML患者中抗原漂移的频率达到50.00%～91.00%，严重影响了检测准确性[5]。而基于DFN的MFC-MRD检测方法可识别免疫表型与正常骨髓干/祖细胞不同的原始细胞群，而无须诊断时预先确定的LAIPs，从而有效避免了免疫表型漂移[6]。

1.2RT-qPCR RT-qPCR现已成为AML-MRD检测最常用的分子技术。主要检测对象：(1)融合基因，如CBFβ-MYH11、RUNX1-RUNXT1及MLL基因重排等；(2)白血病相关基因突变，如FLT3内部串联重复序列(FLT3-ITD)、核仁磷酸蛋白1(NPM1)等；(3)基因过表达，如肿瘤易感基因1(WT1)、嗜亲性病毒整合位点1等。其结果通常以被测基因转录产物的拷贝数相对于管家基因拷贝数的百分比表示，治疗前后值的变化以对数形式表示[6]。其中常见融合基因及NPM1基因突变等已被研究证实作为理想的MRD检测靶点，在成人及儿童AML中均具有重要的预后意义[6-8]。然而WT1基因虽然在80.00%～90.00%的儿童AML中过表达，但受正常细胞中背景表达水平的影响，其高表达水平仅在小于50.00%的患者中可检测到，故尚未纳入AML-MRD检测常规[9]。

1.3NGS AML是一种具有高度遗传异质性的恶性疾病，在疾病发生、发展过程中有多种基因异常参与，目前，较为重要的包括白血病启动突变，如表观遗传调节因子——DNA甲基转移酶3A、TET癌基因家族成员2、ASXL1、异柠檬酸脱氢酶1/2突变，与不良预后相关的RUNX1、TP53、FLT3-ITD/酪氨酸激酶结构域、KIT突变，以及通常提示良好预后的CCAAT增强子结合蛋白A突变等。这些基因突变中的一部分已被确定具有直接的诊断、预后和靶向治疗意义[10]。NGS的主要测序技术：(1)全基因组测序WGS；(2)全外显子测序WES；(3)靶基因测序[9]。NGS能直接通过DNA重测序检测到上述基因异常，其中对于将NPM1及FLT3-ITD突变作为AML-MRD的检测靶点，多项研究已证实其具有比PCR检测更加突出的优势，能有效解决其克隆异质性的问题，甚至为靶向治疗提供有力信息[11-12]。但明确有力的白血病相关基因突变可作为NGS-MRD检测标记及NGS的临床价值仍需大量前瞻性研究证实，并在各个实验室之间实现标准化和协调化。NGS进一步弥补了MFC及PCR的局限性。同时，新兴的PCR技术——数字PCR能直接定量和克隆扩增目标核酸，无须标准曲线，也体现出相较于RT-qPCR，数字PCR具有更大的使用范围和灵敏度[13]。

因多种检测技术各有其优缺点，如MFC的突出优势在于其广泛的适用性，PCR、NGS却具有更高的灵敏度；PCR的适用范围相对狭窄，而NGS的临床价值尚有待于验证等。在JONGEN-LAVRENCIC等[14]提出多种检测技术结合可提高灵敏度，增加预后判断的准确性。因此，在不同的时间点和不同类型AML患者中选择合适的MRD检测方法或组合方法也许是更高效的策略。

2 MRD评估在AML临床实践中的应用

目前，儿童AML的治疗药物主要包括抗代谢药(阿糖胞苷或6-巯基嘌呤)、蒽环类药物(柔红霉素或伊达比星或米托蒽醌)、依托泊苷等。治疗方案经过诱导化疗(通常为2个疗程)和缓解后强化化疗(2个或3个疗程)或造血干细胞移植(HSCT)。各个国际组织的治疗方案虽然在治疗药物的强度、累积剂量和蒽环类药物的选择方面有所不同，但最终结局大致相同，诱导治疗后CR率可达85.00%～90.00%，然而其中20.00%～41.00%的患者最终复发，5年无事件生存率(EFS)仅为40.00%～60.00%[15]，这种高复发率与MRD密切相关。2017年欧洲白血病网络[1]和国家综合癌症网络[16]关于成人AML最新的指南中已经提议将MRD评估用于成人AML临床实践中。

近10年来，大量回顾性研究表明，无论检测方法、标记和治疗策略的不同，特定时间点进行MRD检测呈阳性或MRD水平升高是儿童AML患者复发和生存期缩短的独立预后因素[15,17-18]。一项在142例儿童AML的研究中分别在2次阿糖胞苷、伊达比星联合依托泊苷(ICE)方案诱导治疗后使用MFC进行骨髓MRD评估，将大于0.10%作为MRD阳性阈值，结果显示，ICE1后8年MRD阳性和阴性患者无病生存率(DFS)分别为73.10%、35.20%，差异有统计学意义(P<0.05)，8年OS分别为82.20%、51.60%，差异有统计学意义(P=0.000 5)，8年累计复发率(CIR)分别为23.50%、62.80%，差异有统计学意义(P=0.000 5)，ICE2后得出了相似的结果，且ICE1后MED呈阳性的患者即使在ICE2后MRD转为阴性，仍有较差的预后，多因素分析结果显示，诱导治疗后MFC-MRD阳性是DFS、OS、CIR的独立不良预后因素[15]。虽然治疗策略、样本量和MRD阈值(0.10%～0.25%)略有差异，但多项基于MFC的MRD评估研究中MRD阳性与较差的无复发生存率和CIR相关[3,17]。即使上述研究均为回顾性研究，在一定程度上缺乏随机性，但已经提示诱导治疗后MRD阳性患者拥有更高的复发风险，应纳入临床试验进行基于风险的治疗分配(如HSCT)。

以融合基因作为靶点进行的MRD评估相关研究同样证实了其临床适用性。GAO等[18]在对初次诊断为t(8;21)AML的55例中国儿童的研究中在治疗及随访过程中以RT-qPCR动态监测RUNX1-RUNXT1转录本，首次诱导后将RUNX1-RUNXT1转录本下降小于2log的患者和大于或等于2log的患者进行比较，结果显示，5年无复发生存率分别为71.60%、48.10%，差异有统计学意义(P=0.016)，5年OS分别为76.90%、48.90%，差异有统计学意义(P=0.012)，5年CIR分别为24.3%、52.60%，差异有统计学意义(P=0.003)；同时，在监测到分子复发的16例患儿中及时采取HSCT 2例患儿未复发，其余14例未采取抢先治疗措施的患儿最终均发展为血液学复发，且中位时间为4个月。其他监测融合基因转录本动力学变化的儿童AML研究得出了相似的结论；多因素分析结果显示，特定时间点(首次诱导后或巩固治疗后)融合基因转录本阳性或水平升高是不良预后的独立危险因素[19]。目前，虽然暂时缺乏将NPM1基因突变和WTI过表达作为MRD监测靶点在儿童AML中预后价值的相关数据，但在成人的研究中有喜欢文献报道，NPM1和WT1转录水平升高是高复发和死亡风险的一个重要因素[20-21]。

对儿童AML患者的风险分层通常以诊断时参数(如诊断年龄、白细胞计数、细胞遗传学及法美英分型)和初始治疗反应为标准，其中最重要的是细胞遗传学和初始治疗反应，2017年欧洲白血病网络提出以细胞遗传学将成人AML患者分为3个危险组[1]。然而越来越多的证据显示，MRD是评估早期治疗反应的重要参数。已有将成人AML患者按MFC-MRD检测结果进行风险分组的文献报道，在不同LAIPs表达水平的风险组中3年CIR也各有差异，提示将MRD用于AML风险分层的可行性；但其并未根据MRD制定特定的治疗策略，尚需进一步验证[22]。BUCCISANO等[23]将MRD与遗传学异常相结合的综合评价改善了风险评估方法，并提出在高危组和缓解后MRD阳性患者中推荐使用HSCT，而对于低危组中获得MRD阴性的患者HSCT并不能改善其预后，甚至可能因此受到损害。

儿童AML治疗过程中标准化疗虽然能提高AML患儿存活率，但化疗药物通常存在明显的不良反应，同时，在强化治疗策略的选择中低危者大多数采用化疗的治疗方式，而高危者被认为是HSCT的适应证，但中危、难治性及复发患者的治疗方案选择目前尚无明确的标准。因此，精确地评估初始治疗反应，进行更准确的风险分层，从而确定个体化的治疗方案，避免中、低危尤其是中危患者由于过度治疗带来的损害及并发症是必需的，同样，早期识别高危患者，及早给予强化治疗和HSCT以提高OS也是必要的。ZHU等[24]在成人AML的相关研究中以RUNX1-RUNXT1为MRD检测靶点，仅以MRD水平作为风险分层标记，将风险导向治疗与非风险导向治疗组进行比较，接受异基因HSCT的高危患者CIR明显低于仅接受化疗的患者(分别为22.10%、78.90%)，差异有统计学意义(P=0.000 1)，长期DFS明显升高(分别为61.70%、19.60%)，差异有统计学意义(P=0.001)。证实将MRD评估纳入缓解后治疗决策可能是患者获得与疾病侵袭性所需的集中治疗、改善预后的关键措施。然而，目前尚无证据证明早期干预MRD阳性的AML患者能有效改善预后，需要在早期干预治疗相关死亡方面的潜在代价和MRD阳性复发风险之间权衡利弊[25]。

考虑化疗药物的不良反应，近年来，血液学家将目光转移到分子靶向治疗方面，其中吉妥珠单抗(GO)已进入儿童AML一线Ⅲ期临床试验[26]。RUBNITZ等[27]在232例儿童AML患者中通过MFC检测MRD，以0.10%为阈值，在第1次诱导后根据MRD水平决定第2次诱导治疗的策略，MRD阳性患者行阿糖胞苷、柔红霉素联合依托泊苷(ADE)+GO方案治疗，MRD阴性患者继续ADE方案，2次诱导治疗后根据MRD水平和遗传异常进行风险分层，高危组分配为HSCT，低危组行3个疗程的强化治疗，标危组仅在同胞供体匹配情况行HSCT，结果显示，在接受ADE+GO方案治疗的MRD阳性患者中大部分MRD水平降低甚至转阴，AML患儿整体3年EFS为63.00%，OS为71.00%，略优于现有数据，提示MRD指导的风险导向治疗可能改善AML患者的预后。然而O′HEAR等[28]研究表明，对于接受与未接受GO治疗的患儿比较，虽然诱导治疗后MRD水平降低更明显，但5年OS、EFS、CIR并无明显差异。提示目前尚无确凿证据证明早期干预MRD阳性的AML患者能改善其预后，尚需大样本前瞻性随机试验证实。

3 移植应用

目前，在儿童AML患者中HSCT仍是高危患者缓解后治疗的最佳选择，但对适宜进行移植患者的选择仍依赖于传统的风险分层，MRD在移植前后的预后意义和对选择移植强化治疗的指导意义仍在研究中。关于移植前MRD与AML预后关系的19篇meta分析结果显示，移植前MRD与更差的DFS(危险比=2.76，95%可信区间：1.90～4.00)、OS(危险比=2.36，95%可信区间：1.73～3.22)、CIR(危险比=3.65，95%可信区间：2.53～5.27)相关，但与无复发死亡率(危险比=1.12，95%可信区间：0.81～1.55)无关，而且此结果在各种不同的检测方法、治疗策略和患者年龄等情况下均成立，表明移植前MRD与移植后复发风险以及生存时间密切相关[29]。

对于移植指征的选择，高危患者通常是最佳适应证，标准风险患者仅在有可匹配的供体时选择，但据文献报道，诱导后MRD评估可能重新定义HSCT的指针选择。ZHU等[24]研究表明，MRD阳性患者受益于HSCT，而MRD阴性患者则效果更差。随后在法国的一项关于成人NPM1的研究中同样证实了这一观点[20]。但遗憾的是，上述研究并不具备随机性，同时，儿童AML中也缺乏类似的多中心前瞻性随机试验数据证实其准确性。

4 小 结

虽然已有大量证据证实MRD在AML临床实践中的应用价值，但由于当前所面临的挑战，目前MRD在非急性早幼粒细胞白血病的AML中的重要性尚有待于提高。这些困难包括上述提出的检测方法、检测标本及阈值尚有待于统一的问题，以及大量MRD假阳性和假阴性的存在，表明各种检测方法的灵敏度和特异性均有待于提高，甚至需开发有更高灵敏度及适用性的检测方法。其次，疾病异质性也是制约条件之一，有研究表明，检测到常见遗传学异常，如NPM1、FLT3-ITD、RUNX1-RUNXT1、CBFβ-MYH11突变及常见LAIPs的AML患者仅占所有病例的60.00%；且作为分子靶点的LAIPs及基因突变拷贝数及种类在病程中可能随着白血病细胞群数量的变化而成比例变化，缺乏白血病干细胞通用的表面标志物；以及缺乏随机性及前瞻性研究，现有的几乎所有研究均为回顾性研究，普遍存在治疗方法异质性、研究队列太小等问题，缺乏不同人群、不同治疗方法、不同AML亚型、不同疾病状态及不同检测方法的前瞻性随机试验证实在AML中引入MRD进行综合评估的必要性。

目前，MRD检测正逐步从实验研究阶段向临床实践阶段发展，尽管MRD检测技术在AML临床实践中的应用尚有待于进一步研究，但从现阶段研究来看，将MRD评估引入儿童AML患者预后分层是MRD指导治疗新时代的开始，极有可能在不久的将来为患者制定个性化精准治疗，从而避免AML患者治疗不足或过度。