天然来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法综述

薛欣怡，张 翼，刘亚月

广东海洋大学食品与科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，湛江市脑健康海洋药物与营养品重点实验室，广东海洋大学海洋药物研究所，湛江 524088

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)，是一种慢性神经退行性疾病，多发于65岁以上的老年人。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害和执行功能障碍等为特征[1]。目前AD已成为全球范围内亟需解决的社会问题和医学问题。据2020年世界阿尔茨海默病事实和数据报告[2]指出，当年全球该病患者超过5 200万。平均每3秒就有1人罹患AD，预计到2050年该数据将会增长至1.52亿。而在中国，超过1 450万人正在遭受AD困扰，约占世界总病例数的四分之一，居世界首位。但是目前针对该疾病的药物研发却一直没有很好的进展。1998～2017年期间，全球超过146个AD药物在临床阶段宣布失败，临床失败率高达97.3%[3]。2019年我国自主研发的药物“GV-971”宣布上市，这将为患者提供新的用药选择。但该药也只对AD轻、中度患者有效，只能在一定程度上改善患者的认知功能。因此，AD新药研发的形势依然严峻。

目前关于AD的特征性病理变化研究发现，患者大脑表面会出现β-淀粉样蛋白(amyloid-protein，Aβ)的异常沉积，形成老年斑；以及患者脑内Tau蛋白过度磷酸化，在神经细胞内形成神经元纤维缠结，并伴有神经胶质细胞的增生[4]。目前关于AD的发病机制主要有“β-淀粉样蛋白(Aβ)假说”、“Tau蛋白假说”、“氧化应激学说”，“金属离子代谢紊乱学说”，“神经炎症假说”“胆碱能损伤学说”等[5]。其中胆碱能损伤学说是最早提出的关于AD的发病机制学说，也是目前大部分AD药物研发的理论基础。该假说认为胆碱能活性丧失与AD患者的病症严重程度有关。对AD患者进行尸检发现，其基底前脑区域神经元丢失，乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶活力下降，从而导致胆碱摄取合成能力降低，学习记忆功能的减退和认知功能障碍[6]。因此，研制出可以改善体内胆碱系统功能的药物一直是治疗AD疾病的重要方向之一。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)属于丝氨酸水解酶类，主要存在于神经系统中，其活性中心主要由酶解部位、阴离子和与疏水性区域三部分组成[7]。AChE是生物神经传导中的一种关键性酶，能够催化胆碱能突触间隙的神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)水解成胆碱和乙酸，终止信号刺激，阻断神经信号在体内的正常传递[8]。而现有研究表明ACh是参与学习和记忆的最重要的神经递质，故提高脑内ACh水平可有效改善AD患者的认知和学习记忆能力[9]。乙酰胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitor，AChEI)是一种能对AChE进行可逆性抑制的物质，它可使ACh在突触处积累，含量增加，保证神经信号在体内的正常传递，从而改善学习和记忆等功能，是目前临床上最为广泛使用的AD治疗药物[10]。

1 现有AChEIs药物简介

截至目前，FDA批准可用于治疗AD的5种药物中除了美金刚属于NMDA受体拮抗药外，其余4种[他克林(tacrine)、利斯的明(rivastigmine)、多奈哌齐(donepezil)和加兰他敏(galanthamine)]均属于AChEIs[11]。Tacrine是最早用于治疗AD的药物，可改善AD病人的认知和识别功能；但其毒副作用较大，尤其对肝脏毒性大，且会引起体内转氨酶水平的升高。故目前该药物已经很少被使用。Rivastigmine则是一种假性不可逆氨基甲酸AChEIs。它是人工合成的毒扁豆碱的氨基甲酸衍生物，结构中含有季胺基团，但不易通过血脑屏障，治疗效果并不显著[12]，且服用利斯的敏类药物后常会产生泌尿系统与呼吸道系统感染，高血压，心房颤动，神经错乱等各种反应。Donepezil则是目前全世界应用最广泛的AChEI，具有选择性高、作用时间长，耐受性良好，无肝毒性等优点；但大部分患者服用后会产生腹泻、肌痛、呕吐、疲劳、失眠、头晕和肌痉挛等较为显著的不良反应。Galanthamine是从雪花莲和其它几种石蒜科植物中提取出来的生物碱，该药在AD治疗初期，患者有腹痛、腹泻、恶心、呕吐和厌食等不良反应[13]。综上所述，目前临床使用的AChEIs药物都能在一定程度上对AChE进行可逆性抑制，从而改善AD患者的认知水平。但是其大多存在半衰期短或较严重的外周胆碱能系统副作用等缺点，不利于患者长期服用。因此，开发寻找具有适宜患者长期服用、选择性高、毒副作用小、且作用面广等优点的AChEIs受到科研工作者的广泛关注[14]。

2 来源于天然产物的AChEIs

天然产物一直是药物发现的重要资源。目前已发现的AChEIs的来源多为植物和微生物，如现有药物galanthamine和rivastigmine，还有石杉碱甲、毒扁豆碱、小檗碱等也是目前已研发证明具有高活性、选择性强，来源于天然产物的AChEIs[15]。从Eadie等[16]报告中我们得知,早在1864年，Jobst等就从非洲西部毒扁豆PhysostigmavenenosumBalf的种子中分离得到一个四氢吡咯并吲哚环系的天然生物碱—毒扁豆碱，该化合物对AChE具有极强的抑制活性，这是已知最早的天然AChEI。而后国内外科学家从各类中药、动植物、微生物等天然资源中发现了一批具有显著活性的AChEIs。例如，Ramli等[17]从植物Stichoneuroncaudatum中分离得到四个新的生物碱，其中sessilistemonamines E对AChE具有显著的抑制活性，IC50值为9.10 μM。Zhao等[18]从PhlegmariurushenryiChing中分离得到5个新骨架石松生物碱类化合物。药理活性研究表明，化合物phleghenrines A和D具有显著的AChE抑制活性(IC50值分别为4.91和4.32 μM)，同时化合物phleghenrine D对丁酰胆碱酯酶不显示抑制活性，是一个极具潜力的治疗AD的先导化合物。Zhan等[19]从植物Zephyranthescandida的提取物中分离得到了若干个对AChE具有极强抑制活性的新生物碱。Cui等[20]也从中药加味补中益气汤中发现了5个具有显著抑制AChE的呋喃酮类化合物，其IC50均小于12 μM。随着现代分析和物质结构鉴定技术的进步，越来越多的AChEIs被发现，但是这只涉及天然资源中的极小一小部分。自然界中大量的微生物和植物中的AChEIs的筛选工作尚少，具有巨大的开发潜力。但是天然产物成分往往比较复杂，因此选择一种合适的活性模型来对自然界中潜在的AChEIs进行快速筛选，具有重要的意义[21]。

3 天然来源的AChEIs的筛选方法

目前，AChEIs的筛选方法主要有基于紫外分光光度计的Ellman’s比色法、TLC薄层生物自显影法、荧光分析法、液相色谱与质谱联用等方法[22]。

3.1 基于紫外分光光度计的Ellman’s比色法

基于紫外分光光度计的Ellman’s比色法是最早用于AChEIs筛选的方法，其筛选原理为：乙酰胆碱酯酶水解底物硫代乙酰胆碱为硫代胆碱；硫代胆碱再与显色剂DTNB(5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸))反应生成在波长为405 nm处有特征吸收的化合物5-硫-2-硝基苯甲酸。AChEIs的加入可以显著抑制AChE的活性，因此可以通过紫外分光光度计测定吸光度的增减量，进而间接测定待测样品对AChE的抑制活性[23]。2020年Okello等[24]从绿茶中分离得到5种天然黄烷-3-醇化合物，采用Ellman’s比色法筛选其对AChE的抑制活性，发现EGCG对AChE有显著抑制作用，其IC50值小于0.02 μmol/mL。Xiao等[25]从红树林中分离出两个新骨化合物asperterpenol A和asperterpenol B，并采用改良的Ellman’s比色法测定了其对AChE和BuChE的抑制作用，结果发现两种化合物都具有强烈的AChE抑制能力，其IC50值分别为2.3和3.0 μM，但均不能抑制BuChE，可作为一种天然有效的AChE抑制剂。Mahsa等[26]以白杨的甲醇馏分为原料，研究了其粗提物的抗氧化活性及AChE抑制作用，从中检出了五个化合物，并利用Ellman’s比色法发现黄酮化合物quercetin具有较强的抗氧化作用，其IC50值为10.2 μg/mL。而Caffeic acid则表现较强的AChE抑制作用，其IC50值为12.1 μg/mL。综上可知，Ellman’s比色法具有操作简单、耗费低等优点，从而得到了广泛的使用[23-28]。但是由于该法利用的是物质的紫外吸收，而天然来源的化合物多为有颜色的一类物质，易干扰比色法的测定。因此该法不适合于筛选本身具有颜色的化合物，否则容易出现假阳性结果[29]。

3.2 TLC薄层生物自显影法

TLC(thin-layer chromatography)薄层生物自显影法是一种快速靶向追踪分离、筛选活性成分的方法。其原理与基于紫外分光光度计的Ellman’s比色法一致，但此方法的操作过程更为简便、成本更低，且能随时对活性物质进行追踪[30]。此方法通常先将样品在薄层板上展开，然后喷上AChE和显色剂，在恒温恒湿的条件下培养20 min后再喷上适量底物。若样品中成分有抑制AChE活性，则显现白色斑点。Nokuthula等[31]研究了一种南非苋科植物抑制AChE的活性实验，并进行活性化合物的分离与其结合酶分子对接能力的检测。在利用TLC技术对41个代表样品进行AChE抑制活性体外评价时发现，活性最强的品种为AmaryllisbelladonnaL、Nerinehuttoniae和Nerineundulata(L.)，其IC50值分别为14.3、45.3和52.8 μg/mL，并在甲醇提取物中追踪到若干个具有显著活性的化合物，为后续研究提供了较为可靠地实验依据。Cai等[32]对从Piper等芳香植物中提取的23个香精油(EOS)进行化学成分分析发现其中富含倍半萜和苯丙烷类，采用TLC对组氨酸二聚体中活性最强的活性成分进行鉴别，最终确定其为细辛霉素，对AChE具有较好的抑制作用(IC50值为0.44 mg/mL)。Fabio等[33]对来自加勒比海的软珊瑚(Eunicea和Plexaura)分离出的14种化合物进行AChE抑制活性评价，发现化合物asperdiol、asperdiol diacetate和8R-dihydroplexaurolone均显示较强的活性斑点，并对化合物14-acetoxycrassine和asperdiol进行定量检测，其IC50分别为1.40和0.36 μM。Zhang等[34]采用TLC薄层生物自显影的方法对44株海洋来源真菌的AChE活性成分进行了筛选与追踪，研究发现有32株真菌具有明显的AChE抑制斑点，表明其中含有潜在的抑制AChE的活性成分，这为结构多样化AD活性物质的研究提供了有益启示。但此方法耗时较长，误差大，易出现假阴性结果，一般只能用于定性测定，研究者经常将TLC薄层生物自显影法与Ellman’s比色法联用，以保证实验结果更加真实可靠[35]。

3.3 荧光分析法

荧光分析法也是一种可用于天然AChEIs的筛选方法，具有高灵敏度、检测下限低、简单快速等优点。其筛选原理主要是利用物质的荧光特性，当无荧光的物质在被AChE水解后会生成有荧光物质，可以通过监测该物质的荧光变化情况间接测定AChE活性，常采用的是荧光探针和荧光猝灭效应等方法[36]。Cai等[37]以荧光银纳米簇DNA-AgNCs为载体，根据氯化硫代乙酰胆碱被AChE水解后生成的TCh会与DNA-AgNCs反应使DNA-AgNCs的荧光性增强的原理，检测了tacrine在635 nm处的荧光变化情况，得出其IC50为4.7 nM。该结果比文献报道值小，这说明此方法酶与底物的用量比其他方法少，更加经济方便。Han等[38]利用硫代胆碱对方酸染料的荧光猝灭效应，根据氯化乙酰硫代胆碱和ACh能竞争性的与AChE结合的原理，来调控硫代胆碱的生成量，使体系的荧光信号发生改变。结果表明当待测体系中存在有机磷抑制剂时，AChE的催化活性受到有机磷的特异性抑制，酶对底物的水解作用减弱，硫代胆碱的生成量也会相应的减少，体系荧光信号发生改变，最终可实现对有机磷的检测。Liu等[39]采用荧光分析法研究了香豆素类化合物与AChE相互作用，发现该类化合物对AChE的内源荧光具有较强的猝灭作用。但荧光分析法的缺点是稳定性差，易受干扰，并且不是所有物质都具有荧光性，因此它的使用范围受到较大限制。

3.4 液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱-质谱法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)是近代发展起来的以HPLC为分离手段，MS为鉴定工具的高效分析分离技术。其原理是底物乙酰胆碱在AChE的作用下生成胆碱，经过HPLC分离后，通过MS测定其底物的减少量来间接确定待测样品的AChE抑制活性。该方法将HPLC对复杂样品的高分离能力与MS的结构鉴定能力结合起来，具有分析速度快，灵敏度高等优点[40]。尤其对于缺乏特征紫外吸收和不易分离的物质具有独特优势。Gokhan等[41]利用HPLC-MS方法对Ferulahalophila的诱变/抗诱变活性进行评价，建立了该植物的化学成分谱。实验发现在丙酮提取物中酚类和黄酮类的含量最高，氯仿提取物对AChE的抑制作用显著，表明该植物可能是一种有希望的AChEI来源，具有较高的生物潜力与药用价值。Placines等[42]采用HPLC-MS对可食用盐生植物CakilemaritimaScop的主要代谢产物进行定量和AChE抑制试验，发现其类黄酮提取物对AChE具有显著的抑制活性。Zhao等[43]利用HPLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS技术发现Coptischinensis植物根茎中的五种生物碱类化合物均具有较好的AChE抑制活性，其中化合物palmatine的活性最好，IC50值为36.6 μM。Kahraman等[44]也通过该技术比较了F.caspica和F.halophila根茎与地上部分的植物化学特性，实验发现5-caffeoylquinic acid是F.caspica和F.halophila提取物中的主要成分，其甲醇提取物都有较高的AChE抑制活性与抗氧化能力，且F.caspica地上部分的甲醇提取物比F.halophila的AChE抑制活性高，其IC50值为0.044 33 μg/mL，这可能与它们提取物中总酚与类黄酮的含量有关，但F.caspica氯仿提取物的高总酚含量与其抗氧化活性和AChE抑制活性无关。

超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatograph，UPLC)是近年来发展起来的一种适用于微量或痕量物质快速检测的技术。它是在传统的HPLC方法上发展的，采用更小颗粒填料色谱柱、更快速的检测手段及超高压系统结合的新兴液相色谱技术[45]。与传统的HPLC相比，UPLC具有高分离度、高速度、高灵敏度等优点。在全面提升HPLC的速度、灵敏度和分离度诸品质的同时，保留其原有的实用性及原理[46]。其最显著的优势是可以缩短分析时间，提高工作效率。如针对某有关物质进行分析，使用HPLC运行1针需要75 min，而UPLC只需要10 min就可以完成整个过程，分析效率提高将近7.5倍。当然，分析效率提高这么多，其配套设备要求也随之增加。UPLC需要小颗粒杂化填料(1.7 μm)的色谱柱、更高耐压(达15 000 Psi)、低系统体积的输液单元[47]。由于此方法具有高分离度，高灵敏性，分析周期短等优点，可为复杂、痕量物质体系的分离分析提供良好的平台。现已广泛应用于农药残留物检测，水质和环境监测，化妆品质量控制，中药复杂组分分析及代谢组学等领域。

Wang等[48]采用亲和超滤超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质结果实验发现这四种药用植物都具有较强的抑制活性。其中钩藤中的活性化合物可能为3-二氢异卡丹宾、钩藤碱、柯诺辛等。Liu等[49]采用UPLC-Q-TOF-MS技术对D.auriculatum植物的化学成分进行调查，发现其中有五个生物碱化合物均表现较好的AChE抑制活性，其IC50值为0.24～6.37 μM。Farag等[50]基于UPLC-MS技术检测Ocimum植物的AChE抑制活性，并对O.basilicum、O.africanum、O.americanum和O.minimum四种酚类物质的代谢差异进行评估，结果发现O.americanum、O.africanum、O.basilicum的IC50值为2.5～6.6 mg/mL，并且对从Ocimum提取物中获得的化合物caftaric、chlorogenic和rosmarinic进行活性测试，得出其IC50值分别为24、0.5和7.9 mg/mL。采用UPLC方法进行分析可极大的提高其分析效率，但同时对样品的前处理要求也更严格。如果样品前处理不干净就会有很多杂峰，基线也会很高；同时由于UPLC色谱柱的填料粒径均很小，因此容易造成色谱柱堵塞。最后由于实验过程中仪器内部压力过大，也会产生相对应的问题。例如泵的使用寿命会相对降低，仪器的连接部位老化速度加快，包括单向阀等部位零件容易出现问题等[51]。

4 总结

天然产物由于其本身具有结构多样化等优势，是目前最大、最好的药物来源库。随着提取分离和结构鉴定技术的快速发展，从天然产物中开发药物的速度和竞争力显著提高[52]，这为寻找作用面广，毒副作用小，适合长期服用的新型AChEIs提供了新思路。同时随着针对AChEIs筛选的科学技术的不断创新，科学仪器的不断进步，并且对AD的确切病因研究逐渐深入，我们坚信会从天然产物中发现更多化学结构新颖，效果显著的化合物，最终战胜AD。