诱导性多能干细胞移植治疗帕金森病的研究进展

姚盼盼 周斌杰 余勤*

帕金森病（PD）又名震颤麻痹，是一种多发于中老年人群的神经系统变性疾病［1］。目前研究认为，PD发病机制为脑内黑质纹状体病变，导致多巴胺能神经元（DN）变性死亡，释放的多巴胺（DA）含量降低，从而使患者运动不能。但引起黑质纹状体病变的原因仍不明确。诱导性多能干细胞（iPSCs）是指利用载体将特定的转录因子转染已分化成熟的体细胞，通过重编程技术将其诱导成为具有胚胎干细胞（ESCs）特性的多潜能性干细胞［2］。近年来，iPSCs在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用日益凸显，iPSCs已在体外被成功分化为神经干细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等［3-5］，其在临床疾病的治疗中显现出巨大的潜能与应用价值。

1 帕金森病临床治疗现状

PD是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见慢性神经退行性疾病，目前临床主要治疗手段包括药物治疗、手术治疗、基因治疗，及康复训练等［6-7］。由于该病发病机制与致病因素尚不明确，所有的治疗均只能改善患者的生活与工作质量，并不能阻止疾病的发展，结局即患者丧失生活能力。因此，继续寻找有效的治疗方法对PD具有重要意义。

1.1 药物治疗 作为治疗PD的首选方案。目前，治疗运动症状的药物有两类，一为增强多巴胺能作用的药物，多巴胺受体激动剂或多巴脱羧酶抑制剂，如盐酸普拉克索、吡贝地尔缓释片、卡左双多巴控释片、恩他卡朋片等；另一类为抗胆碱能药物，如盐酸苯海索等。由于通常需要联合用药并长期服药以控制症状，因此易出现药效减退、“异动症”等［8］。

1.2 手术治疗 当药物治疗出现剂末现象时，患者可以选择手术治疗。手术治疗PD的方法主要有两种，即神经核团毁损术和脑深部电刺激手术（DBS）。神经核团毁损术，可根据病征的不同选择不同的靶点进行手术，其关键在于靶点的精确定位以及毁损灶大小的制作，但靶点定位受多种因素影响，术后易出现多种严重并发症，且易复发［9］，因此已逐渐被DBS所替代。目前，DBS已在国内外广泛应用，该手术对脑组织结构破坏极小，属于微创手术，具有可逆性和可调节性，但脑起搏器价格较为昂贵，需要在脑内永久性植入，存在移位和颅内感染的风险［10-12］。

1.3 基因治疗 通过将目的基因导入相关脑区来影响特异性蛋白质的表达，以期延缓多巴胺能神经元的丢失或纠正神经递质失衡［13］。LRRK2、PARKIN、PINK1、GBA等基因被认为与PD发病直接相关［14］，近年来有多项临床研究尝试通过立体定向手术导入靶基因，从保护多巴胺能神经元、提高多巴胺递质、拮抗抑制性神经递质等不同角度治疗PD［15］。目前的基因疗法尚需开颅将病毒载体注射到患者大脑中［16］，术后易出现头痛、脑水肿、恶心等并发症［17-19］，故治疗方法并不适用早期PD患者。因此，改善基因疗法的施药方法，降低其侵入性，是今后研发的重要方向。

2 诱导性多能干细胞与帕金森病

早期的细胞疗法中，治疗中枢神经系统疾病是将神经干细胞诱导分化成特异性神经细胞，然后移植到大脑受损区域，可在一定程度上改善该区域神经损伤所造成的功能障碍［20］。但成体神经干细胞来源十分稀少，分离与体外培养均较为困难，从而限制了该项技术的应用。此外，ESCs由于具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性，一度被认为是细胞移植治疗的理想来源，但获取人类ESCs（hESCs）需破坏胚胎，因其违反道德伦理引发巨大争议，进而严重影响ESCs的研究发展。iPSCs来源于患者自身，成为研究多种疾病的有效细胞替代来源，并可以消除免疫排斥的风险，满足免疫抑制治疗的需要。iPSCs与hESCs不同，该类细胞不受道德伦理等问题的约束，且细胞来源丰富，在未来临床应用上极具优势。

2.1 iPSCs治疗PD的研究进展 细胞移植治疗若要进入PD临床应用，一个现成的、具有自我更新潜力的细胞来源是必不可少的，并且需具备在移植后分化为DN的潜力。如果DN可以在体外通过干细胞分化由非多巴胺能细胞来源产生，随后移植到大脑，在纹状体中调节DA的释放水平，则有望限制PD 患者的疾病进程，并帮助其恢复运动功能。早在2009年，CHAMBERS等［21］就已获得hiPSCs衍生的中脑DN，并证实其功能与hESCs来源的DN相似。要制备可移植的mDA细胞来源，关键在于确定细胞体外分化的最佳阶段。利用hESCs衍生的DN已对其移植最佳阶段进行了充分研究。BJORKLUND等［22］将少量早期未分化的hESCs植入大鼠体内，功能性DN自发发育，显著恢复6-OHDA损伤大鼠的行为，但也可能导致畸胎瘤的形成。HEDLUND等［23］将晚期完全分化的hESCs植入大鼠体内，纯化的DN可以避免形成畸胎瘤，但移植后存活率极低。MOON等［24］研究表明，“中间阶段”如DN祖细胞相对于完全分化的细胞，可能是一个更优来源。

DOI等［25-26］通过CORIN或LRTM1进行FACS流式细胞术分选hiPSCs衍生的DN祖细胞，移植给6-OHDA损伤的大鼠后，显著改善其运动行为，并且未形成畸胎瘤。通过测试来自健康个体或PD患者iPSCs衍生的CORIN分选DN祖细胞的存活率和功能，发现DN祖细胞可以改善临床前6-OHDA缺陷大鼠模型的运动功能障碍［27］。KIKUCHI等［28］的临床前试验显示，hiPSCs来源的DN移植到MPTP处理的食蟹猕猴PD模型后，可以控制症状长达2年，具有显著疗效且无畸胎瘤形成，进一步证实了基于iPSCs自体细胞治疗PD的潜力。2018年《Nature》［29］报道，全球首个iPSCs治疗PD的临床试验获批，Takahashi及其团队将使用iPSCs培养成的神经前体细胞移植到PD患者大脑中，以期移植的细胞发育成神经元并释放多巴胺，并将检测iPSCs治疗PD的有效性和安全性。

2.2 iPSCs临床应用面临的问题与挑战 （1）安全性：iPSCs的产生涉及两个主要过程：一是将编码重编程因子的载体递送至靶细胞，二是重编程因子的强制表达。虽然多年来重编程因子几乎没有变化，但是基因转入技术已经取得了重大进展。最初的重编程方案使用逆转录病毒或慢病毒作为载体，通过四个外源转录因子诱导体细胞重编程，其中包括原癌基因c-Myc。虽然这些基于病毒的iPSCs已用于疾病机制研究，但被认为不适合临床应用，因为整合的病毒序列可使多种染色体产生畸变，可能导致遗传功能障碍或肿瘤的形成［30-31］，从而给移植后的患者带来潜在、不可预估的安全风险。因此，基于iPSCs的细胞疗法若要成为临床可行策略，必须建立安全有效机制，从可移植细胞群中去除任何可能保留形成畸胎瘤潜力的残余未分化细胞。DOI等［32］已研究评估临床级hiPSCs系衍生的DN祖细胞的安全性和有效性，并正在进行PD临床试验。（2）诱导分化效率低：虽然近年来已有研究使用非慢病毒整合型载体、其他重编程因子，及多种基因转入方法来诱导iPSCs分化为DN，并取得一定实质性进展，但产生的仍是DN和其他非典型的细胞类型混合物［33-36］，存在诱导分化效率低的问题，可能会给移植后患者带来不可预估的安全风险。因此，若想获得足够数量、高质量、可用于临床移植治疗等级的DN来治疗PD，还需提升体外诱导iPSCs细胞定向分化的精确性及高效性。（3）细胞制备技术：不同实验室对iPSCs诱导分化的方法和结果有一定差异，一旦在动物模型中验证和优化了可移植细胞来源，还必须解决与细胞制备和处理相关的技术问题。因此，移植前规范的细胞制备流程、可扩增性、冷冻和解冻的稳定性等问题仍需进一步研究。已有研究发现衍生自小鼠和人多能细胞的DN祖细胞可扩增，并且能够在不丧失功能的情况下经历冷冻和解冻［37-38］。

3 展望

随着全球逐步进入老龄化社会，PD患者人数正在急剧上升［39］。PD发病机制复杂，与遗传、年龄、环境等诸多因素相关［40］，是一种慢性、高特异性的老年疾病，目前其临床治疗仍存在较大难度，无法达到根本治愈。因此，寻找更加有效的治疗方案是未来研究PD的重要方向。iPSCs的出现为多种复杂疾病的治疗带来了一道曙光。近年来，众多研究者采用各种方法对iPSCs进行诱导，以使其在多种疾病中发挥细胞替代作用。2017年，MANDAI等［41］报道了第一例通过移植一片源自异体iPSCs的视网膜色素上皮细胞治疗年龄相关黄斑变性的患者，术后1年未出现任何不良反应，并且治疗眼睛的敏锐度非常稳定，强烈支持基于自体iPSCs疗法在未来临床应用的可行性。目前，尽管临床应用iPSCs治疗神经系统疾病仍处于探索阶段，但就该技术发展的稳定性、伦理和法律问题、免疫原性及可行性而言，相信在不久的未来，基于iPSCs的细胞疗法必将应用于临床，为人类疾病的治疗带来新希望。