食管吻合口瘘动物模型研究进展

张嘉伟 王健生 张广健 付军科 屈航英 张佳

食管癌是全世界最致命的恶性肿瘤之一[1]，自1970年以来，食管腺癌的发病率增加了350%，超过了其他所有实体恶性肿瘤[2-4]。食管癌因缺乏早期临床症状，通常在晚期被诊断[1]。食管切除仍然是唯一根治性治疗食管癌的方法[4]，术后吻合口瘘是食管癌患者手术后非常严重的并发症。尽管当前外科从业者已经开发了新的手术技术和新的生物材料以降低术后并发症的发生及其引起的死亡，但是在食管癌患者进行根治性手术后，吻合口瘘仍然是常见的并发症之一，术后吻合口瘘能够引起严重的胸部或纵隔感染，这种并发症仍然是与手术有关死亡的主要原因。吻合口瘘延长了住院时间，增加了费用，延长了后续治疗的时间，且是术后肿瘤复发的独立危险因素[5]。对于研究者来说，在选择一种动物模型来重建和研究食管吻合口瘘时，必须进行与食管癌根治术后患者相似的重建。由于胃解剖学和血管与人类的类似性和可行性，目前使用的动物如大鼠[6]、兔[7-9]、犬[10]、 猪[11-13]作为建模动物是一种普遍现象。食管吻合口瘘动物模型的成功建立，模拟了食管癌根治性手术后发生食管吻合口瘘的病理生理过程，并为临床医生进行下一步的治疗提供技术支持。

一、食管吻合口瘘的现状

1. 术后食管吻合口瘘潜在危险因素

食管吻合口瘘的发生原因可以分为3大类：人体正常生理与解剖因素、围手术期期间的环境以及外科操作相关因素。与食管吻合口痿发生有关的解剖学因素包括食管缺乏浆膜、食管肌层为内环形外纵形，食管黏膜下层与外膜均为疏松结缔组织形成，质地脆弱。以上因素致使食管吻合时缺乏承受缝线的拉力，且食管外层肌纤维由于解剖原因恢复缓慢，客观上加重了吻合口缝线的拉力。生理因素包括：由于胸腔纵隔内压力是负压，这就容易促使消化道内容物通过吻合口处进入纵隔内形成吻合瘘口，在各种化学因子作用下，对瘘口周围组织产生严重化学刺激，加上唾液中大量口腔厌氧菌协同作用，加速加重炎症和继发感染的进展，致使吻合口处吻合口瘘的发生并导致恶性循环。围手术期因素表现在严重营养不良患者，术前血清白蛋白低容易发生吻合口瘘[14]。若患者伴有慢性疾病，例如肝硬化、肺部疾病等，使机体对于手术创伤的应激反应差，影响组织愈合。另外，术前新辅助化疗是食管癌术后吻合口瘘的危险因素之一[15-17]。术后胃排空障碍也可能与发生吻合口瘘有关。决定吻合口瘘是否发生，外科操作技术因素更为重要[18]。食管癌根治术后患者并发症的发生情况也与手术入路、术中吻合方式及位置有关，有研究报道经右胸入路手术较左胸入路手术在降低吻合口瘘发生率方面更具优势，而且术后肺部炎症发生率也相对较低[19]。此外，食管替代物的选择、吻合口血供、张力等也是影响吻合口瘘的潜在危险因素[20]。

据报道，切除多器官合并症[21-22]、肺功能下降、大网膜切除术以及长期使用类固醇与吻合口瘘的发展有关[23]。女性患者、腹腔镜手术、术后白蛋白水平明显降低和肾功能障碍被确定为独立的危险因素[5]。而肿瘤分期、淋巴结分期、邻近器官切除、吻合强化、淋巴结清扫数量、肿瘤浸润性和早期肠内喂养与吻合口瘘的发生没有显著相关性[24]。一项关于食管胃切除术动物模型中缺血调节时间对吻合口愈合的影响的研究表明，食管切除和食管胃造口术前的胃缺血调理可以减少炎症和胶原的沉积，同时增加吻合口处新生的血管数量。在大鼠模型中，血管内皮生长因子的表达和血管生成的增加已被证明能够改善肌皮瓣的血流量和缺血调理后移植物的存活，改善吻合口的生理状态，降低吻合口瘘的发生[4]。

2. 治疗现状

2.1 保守治疗

吻合口瘘的保守治疗对无症状且较小的食管瘘有相关的专家共识[25]，即以“三管一禁”为基础，在禁水的前提下保证营养管、胃肠减压管和胸腔闭式引流管的通畅。根据瘘口位置、大小及渗液引流情况来综合考虑、密切观察、随时调整治疗方案。保守治疗一般包括通畅引流、抗感染治疗、营养支持3大方面。通畅引流是指吻合口瘘发生后，明确积存液体位置，行有效的胸腔引流，减少吻合口化学刺激，促进愈合。抗感染治疗是指给予足时足量的抗感染治疗，来达到预防或治疗目的。营养支持治疗是术后吻合口瘘愈合的基础，给予肠内营养能够促进肠道功能恢复，加快吻合口瘘的恢复与愈合[15]。

2.2 手术治疗

对于修复较大的且保守治疗失败，尤其已合并纵隔胸腔、脓毒症的食管吻合口瘘，目前治疗方案仍存在争议[26-27]。临床上治疗食管吻合口瘘的方法主要为内镜下治疗吻合口瘘。近年来内镜下吻合口瘘修补术作为一种更便捷的治疗选择，其具有创伤小、手术时间短、耐受程度高等优点，被临床医生逐渐接受[28]。目前国内内镜下治疗吻合口瘘的常用技术包括覆膜支架置入术、尼龙绳缝合术和钛夹夹闭术[29]。覆膜支架置入术的技术成功率可达93%～100%，该技术是一种成熟度很高的治疗方法，缺点是患者可出现支架移位、脱落等风险[30-31]。尼龙绳缝合术采用钛夹将尼龙绳固定在瘘口周围通过收紧尼龙绳达到外科荷包缝合的效果以封闭瘘口，缺点是技术要求较高。国内外报道了一种采用新型材料OTSC的钛夹夹闭术，是一种具有修补面广、吻合力可闭合消化道全层、定位精确、操作简便等优点的内镜技 术[29,32-34]。随着介入、内镜和生物材料技术的不断发展，国内外也开展了一项新的内镜微创技术治疗吻合口瘘——内镜下真空辅助闭合治疗内镜下真空辅助闭合治疗（endoscopic vacuum-assisted closure therapy，EVAC），临床研究发现大多数食管吻合口瘘特别是合并有纵隔胸腔感染的可以应用EVAC来治疗，效果尤其显著[35-42]。目前内镜微创技术发展迅速，是临床治疗消化道疾病的主要研究方向，也是治疗吻合口瘘的主要方法之一。进行二次吻合口瘘修补手术，主要有单纯瘘口修补术、吻合口重建术及食管旷置3种。目前相关文献报道手术治疗吻合口瘘的效果差异较 大[43]。张志宇等[44]治疗的患者术后均出现不同程度的消化液外渗。Crestanello等[45]治疗的患者术后均没有再次出现吻合口瘘。手术疗效优于保守治疗，故对能够耐受再次手术者应积极进行手术治疗。再次手术的主要目的在于修补瘘口，彻底清除胸腔内瘘出物以及脓性分泌物，保证引流管的畅通，减少毒性物质的吸收，从而减轻患者临床症状[9]，有利于吻合口瘘的恢复与愈合。

二、食管吻合口瘘动物模型的选择

管状胃为食管置换行之有效的导管。它是由较大的胃曲度产生的，需要进行大量的胃血运重建。因此，食管胃吻合术的血液供应取决于敏感的显微血管网络。然而，吻合口愈合是一个涉及各种机制，如炎症、血管生成、基质合成和沉积、收缩和重塑复杂的过程[46-47]。因此，吻合的机械强度在手术损伤部位依赖于裂解、合成和胶原蛋白的成熟之间的平衡。而吻合口的机械强度决定了吻合口瘘动物模型建立的成功与否。

在对动物模型进行广泛的研究后，在啮齿动物中，食管胃解剖和血管与人类有相似性和可行性，因此，一些人选择了大鼠模型进行食管胃吻合口瘘的动物模型[6]。但是啮齿动物食管胃吻合口愈合的一个主要问题是食管腔很小。术后吻合口狭窄导致吞咽困难和营养不良。大鼠食管胃吻合腔的构建促进反流和吸入性肺炎。因此，一些研究人员处理了这一技术困难，研究食管或胃伤口愈合作为食管胃伤口吻合口瘘的替代物[48-49]。

大型动物如猪、犬等，食管腔相对较大，采用侧对侧技术进行食管胃吻合术，可获得更大的吻合腔，并保留正常的食管胃路，但由于其食管的解剖和血管情况与我们不同，这种操作需要技术极高的外科医生来进行实验才能保证较高的成功率[50]，并且大型动物如猪、狗等价格比较昂贵，依从性差，且麻醉程度较难掌控，反而增加了动物实验的难度。术后吻合口狭窄会导致吞咽困难和营养不良，因此很难成功建立胃食管吻合口瘘，这些动物模型具有明显的局限性。

食管吻合口瘘中的动物模型研究更频繁地使用兔和大鼠模型，因此在基础实验研究中得到了广泛的应用。相对而言，兔模型相较啮齿类动物具有更简便的操作性、易于观察等特点，且小动物的生理和免疫学与人类的差异更大；关于食管吻合口瘘大动物模型的建立的报道较少，并且其依从性、不可控因素相较兔模型更多。但是，探索大型动物的建立是必要的。

三、构建方法

自1900年代初以来，使用和依赖动物模型研究基本生物学过程和疾病原因的人数一直稳步增长。在105项诺贝尔生理学或医学奖中，其中89项是通过动物研究获得的医学突破。因此，已经提出了令人信服的理由来使用动物模型来理解疾病的病理生理学以及设计新的药物和疗法。

1. 兔食管切开吻合置管法

实验动物为20只为成年健康的新西兰大白兔6～10个月龄，体重为（2.5±0.5）kg。主要仪器：食管支架，实验组所用新型食管可降解支架。建立动物吻合口瘘模型采用食管切开吻合置管造瘘法建立颈部食管吻合口瘘的动物模型。采取兔以3%的戊巴比妥钠按1 mL/kg的剂量经耳缘静脉麻醉，密切观察兔的呼吸频率和节律，以防麻醉过度。将麻醉成功的兔取仰卧位固定，颈部正中切口，切开皮肤，分离筋膜层及肌肉层，沿气管左侧游离出食管，切开全层，置入外径为8F橡胶管以形成食管吻合口瘘，同时将橡胶管沿食管管腔留置于空肠上段充当肠内营养管，后逐层闭合切口，充分固定橡胶管。术后静脉注射广谱抗生素，停止经口进食，经橡胶管给予肠内营养。每隔2天测一次体重，对于体重下降明显者，予5%葡萄糖氯化钠注射液耳缘静脉缓推。建模后1周，将留置的橡胶管取出，该研究成功构建了具有食管吻合口瘘的实验兔动物模型[51]。

2. 大鼠食管胃吻合口瘘法

实验动物：30只雄鼠布朗-挪威大鼠，平均体重320 g，每笼饲养1只，在12 h光照/12 h黑暗循环和特定的无病原体条件下保持在21 ℃。主要仪器：数字手术显微镜。建立动物吻合口瘘模型，采用远端食管胃切除术和胃管形成后的端到端食管胃吻合口处置入硅胶导管然后进行食管胃吻合口瘘的构建。动物采仰卧位，腹部被剃须并消毒。用异氟醚（3%在氧气混合物中，3 L/min）在气体箱中诱导麻醉后，动物被持续的异氟醚麻醉（1.5%在氧气混合物中，3 L/min）。用加热灯将体温维持在37 ℃。另外，皮下注射0.9%NaCl 10 mL，以防止动物术后脱水。围手术期采用安乃唑110 mg/kg镇痛。行上中位剖腹手术，进入腹腔。胃大弯解剖行胃松解术。切取胃短血管和胃左动脉及静脉。保留胃、胃网膜右动脉和静脉。解剖继续向食管裂孔方向推进，腹食管显露。在切除近端小弯、前胃和食管胃交界处后，使用连续缝合形成胃管。在食管远端插入直径为4 mm的硅胶导管以校准吻合口的宽度，然后使用连续缝合线进行食管胃内端端吻合。检测吻合口密封性后，拔除导管，关闭胃管，用5 mL温生理盐水灌洗，闭合腹部，肌筋膜、皮肤用缝线连续缝合。术后，允许动物自由笼养活动，并随意给予水和牛奶。术后镇痛采用口服安乃近（100 mg/d）。动物每天都被称重，并观察是否有疾病迹象。所有的手术由同一位外科医生进行。该研究成功构建了具有胃食管吻合口瘘的实验大鼠动物模型[6]。

3. 猪吻合烧灼法

实验动物：10头雌性约克郡猪。建立动物吻合口瘘模型采用腹部正中切口，行胃食管吻合，然后使用电刀烧灼创建一个约1 cm的圆形缺口以达到吻合口瘘的构建。动物颈背、胸腹部被剃光，皮肤被以无菌的方式准备，采用肌肉注射（IM）xylazine（2 mg/kg）和telazol（6 mg/kg）麻醉，其次是IM glycopyrolate（0.01 mg/kg）、长效四环素（9 mg/kg）和恩氟沙星（7.5 mg/kg）。用2.5%异氟醚对猪进行插管和维持，持续进行心电监护，并用温水循环浴和温暖的乳酸林格溶液加热。留置硅肺导管置于颈内静脉。猪在仰卧位，做垂直中线切口进入腹腔。解剖并暴露胃和食管，分离血管。用线性吻合器将近端胃分割到胃食管交界处的远端。主食线的远端最终将成为胃管道。为确保正确的定位，远端短线被轻轻地缝在胃食管交界处的切割边缘，以帮助在手术后期将导管向上拉入胸腔和胃。然后收腹，将猪变成左侧卧位。后开胸术切开，利用肋骨扩张器进入胸部右侧，解剖暴露在后纵隔的食管。此时，近端胃从远端食管释放，并在管道中进行单独的胃切除术，以引入圆形吻合器。然后切除远端食管的一段，包括胃食管交界处。砧固定在食管末端，并在食管和胃导管之间完成端至端21 mm圆形吻合。一个故意的前1 cm的缺陷，然后创建跨越圆形钉线使用烧灼。放置右侧胸管，关闭右侧开胸术。该研究成功构建了具有胃食管吻合口瘘的实验猪动物模型[52]。

四、模型评价方法

1. 临床与影像学诊断

实验兔食管切开吻合置管造瘘法建立食管吻合口瘘动物模型术后1周，经耳缘静脉将实验兔麻醉，四肢及头部固定，将留置的橡胶管取出，经口插入导管，行X线下食管造影。经导管注入泛影葡胺造影剂，缓慢推注，同时观察摄影并摄片，进行保存，并对瘘口进行测量，造影显示存在造影剂外溢，食管周围见造影剂；自口腔注入亚加蓝，从胸腔或纵隔引流管内引流出染液为造模成功。胸部X线检查提示液气胸，特别是吻合口周围存有液气平面者。另外，反复X线检查胸液量明显增加，或本来无液气平面而突然出现者，无论其多少都具有诊断价值。胸腔或纵隔引流管引出胸水呈灰褐色，有腥臭味者也可提示造模成功。X线造影作为食管癌术后吻合口瘘的常用检查手段，具有简便易操作、高敏感性的优点，其诊断准确率可达93%[53-54]。

2. 宏观诊断

实验猪在术后5 d进行安乐死，在尸检时，打开先前的开胸切口，检查胸腔是否有唾液含量、胃内容物、脓肿或蜂窝织炎形成的证据，确定食管胃吻合口瘘的形成。在术后第5天，所有存活的实验大鼠都被过量麻醉剂安乐死，吻合段十二指肠管腔被直径为5 mm的硅胶导管连接到输液泵上，注入生理盐水（0.9%NaCl），食管腔连接到数字测压仪，吻合段被注入生理盐水（2 mL/min）进行数字监测，压力增加的失效被确定为吻合口瘘的成功 构建。

3. 病理生理诊断

切除包括吻合口在内的1 cm食管段，立即放置在中性缓冲甲醛溶液中，标本固定后，石蜡切片用Masson三色染色进行显微评价。组织病理学显示黏膜下胶原沉积、肌层胶原沉积。食管壁组织HE染色示鳞状上皮部分缺失、坏死，且可见一处增生并突起，内主要为结缔组织和少量肌纤维，病理示食管外纵肌肌纤维局部坏死溶解或肌纤维疏松，瘘口处可见老化的结缔组织形成的瘢痕组织，瘘口处周围炎症反应不明显[9]。

解剖分离食管，观察食管外膜可见到瘘口，周围有充血区，瘘口周围管壁增厚。纵行剖开食管，将食管铺平可见食管内膜瘘口存在，周围稍隆起并有充血，未见明显化脓坏死[9]。

五、小结

食管吻合口瘘是食管癌手术后最严重的并发症之一，其治疗仍是临床难题。当下关于食管吻合口瘘的研究较多关注于临床研究，重点侧重于食管吻合口瘘的诊断与治疗方法的选择，对于吻合口瘘动物模型的建立及治疗相关文献报道较少。目前临床研究者采用动物建立食管吻合口瘘模型，存在操作过程复杂、术后护理条件苛刻、动物依从性差、存活率低等问题，需要花费很多的精力及团队人员去维护动物模型的建立与存活。但不能因此忽略动物模型在临床研究中的重要性，动物模型仍然是生物医学研究必不可少的工具。诚然，使用动物模型研究食管吻合口瘘存在局限性，但是这些研究可以促进食管癌术后病理学的研究，临床吻合口瘘的诊断与治疗药物的动物实验，并且为吻合口材料测试和可能的生物医学成像提供研究资料。期待日后创建更具有综合诊断意义的动物模型，为临床工作提供快速有效的指导，提高临床诊断准确率及敏感性的同时减少患者生活负担，挽救更多患者生命，让患者充分受益，这也是医学工作者今后应该研究探讨的重点方向。