NPM异常表达对肿瘤细胞周期调控作用的研究进展

徐 骏，曹 恩，矢庆明，王 嘉，尹碧洋，况晓东

(南昌大学a.病理教研室； b.第二附属医院骨科； c.玛丽女王学院2018级，南昌 330006)

所有真核生物的核糖体RNA(rRNA)在细胞核中合成，核糖体是细胞合成所需的蛋白质合成的分子机器。核仁磷酸蛋白(NPM)是一种重要的核蛋白，与细胞周期密切相关。NPM在调节细胞周期和凋亡中起着重要作用，主要涉及2个方面：其一，NPM直接影响细胞周期，参与核糖体合成，中心体复制和周期控制蛋白的调节[1]，其二，NPM还可以调节促肿瘤或抑制作用，抑制蛋白的活性并影响其靶基因的下游转录，从而调节细胞的增殖和凋亡[2]。本文就NPM异常表达对肿瘤细胞周期调控作用的研究进展进行综述。

1 细胞周期特征

细胞的生长和增殖在整个生命周期中都受到仔细和严格的调控，G1/S测试点是最重要的调控开关之一。在这一转折点上，细胞对不同的胞内和胞外刺激因素做出各种不同反应，即细胞分裂、细胞分化或生长停止、G1期停止等。同时在此期间，中心体结合的NPM被cyclin E和CDK2异二聚体复合物磷酸化，启动中心体复制[3]。因此，在G1/S这个测试点，任何可能的损伤或者突变，如抑癌基因失活或癌基因激活，都可能导致异常的细胞增殖或转化。有研究[4]表明，NPM蛋白敲除会导致中心粒数制NPM蛋白磷酸化会导致中心体复制失败。

2 NPM的结构与功能

NPM，也称为B23或N038，位于5q35，包括3个亚型，即NPM1、NPM2和NPM3，目前学术界对NPM1了解最为详细。NPM蛋白的N端富含非极性氨基酸，具有组蛋白伴侣的功能，中间部分是核糖核酸酶活性区，负责组蛋白和核糖体的组装，可以依赖乙酰化增加组装水平。C端是含有核定位信号的核酸结合域。野生型NPM可通过核孔在细胞核和细胞质之间穿梭，参与细胞核和细胞质之间的运输。穿梭过程受核输出信号、核定位信号和核仁定位信号序列控制。NPM可以被一些激酶磷酸化，如酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)。NPM和CKⅡ共同位于细胞核中，调节细胞生长和凋亡[5]。

3 NPM异常表达对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响

NPM异常表达，包括基因突变、过表达和沉默表达3种形式，对肿瘤细胞的增殖或凋亡产生影响。

3.1 NPM突变对肿瘤细胞增殖的影响

有研究[6-16]表明，NPM突变对许多恶性肿瘤，特别是对血液肿瘤发生发展尤为密切。

3.1.1 NPM突变与急性髓细胞白血病(AML)

FALINI等[6]首次发现成人AML中NPM1基因突变的检出率为35.2%，正常核型AML中为61.7%，这揭示了NPM基因与血液肿瘤的相关性。近年来，AML中NPM1的异常表达引起了人们的关注和研究。AML中的NPM1突变可发生在FAB-AML的几乎所有亚型中，最常见的突变是M4(发病率77%)、M5a(发病率71%)和M5b(发病率90%)[7]。目前，最常见的突变类型B和D是在相同的基因位点插入CATG和CCTG，而突变类型A是在野生型NPM1核苷酸序列的956-959位插入1个TCTG[8]。NPMI基因第12外显子突变在原发性AML尤其是正常核型AML患者中发生率较高，具有特殊的临床特征和较好的预后[9]。

3.1.2 NPM突变导致NPM突变基因胞浆异常定位

基因突变致NPM胞浆移位的白血病细胞称之为NPMc+细胞。NAKAGAWA等[10]提出，C端色氨酸只在野生型NPM的核仁定位中起主要作用，但是在野生型NPM的细胞质移位中并无显著性作用。当NPM1发生突变后，11-氨基酸残基取代NPM1蛋白C端7-氨基酸，NPM1蛋白末端5个氨基酸均为VSLRK，导致NPM1蛋白C端288和290位点至少1个色氨酸发生突变，削弱了核定位信号，最终导致NPM1在细胞质中的异常定位。此外有研究[11]还发现，突变NPM1的C端产生额外的富含亮氨酸的核输出信号序列，这增强了依赖于CRM1的核输出信号。细胞核定位信号减弱，输出信号增强，最终导致NPM1蛋白在细胞质中的异常定位。

FALINI等[12]通过基因转染技术进一步证实突变NPM移位胞浆是通过CRM1依赖途径，此外通过NES序列敲除实验证明突变NPM只有在同时具有2种NES序列的情况下才能实现其胞浆的聚集。NPMc+的异常表达是多种因素共同作用的结果。

3.1.3 NPM突变(NPMc+)导致血液肿瘤增殖的可能机制

白血病细胞的恶性增殖可以通过p53依赖或p53非依赖途径来促进。一方面，依赖P53途径，通过影响p53的稳定性导致肿瘤细胞异常增殖。P53是一种肿瘤抑制基因，由于其突变常导致肿瘤发生。受损DNA和癌基因的表达被激活，转录反应开始，最终导致细胞周期停滞或凋亡。正常情况下，p53处于动态平衡状态，p53蛋白的稳定性受HDM2(人双微体基因2)调节，HDM2是泛素E3连接酶，下调P53活性。它也由核仁素的抑癌基因蛋白富精氦酸因子(ARF)调节，该因子与HDM2相反。NPM从核仁中分离出ARF。随着基因毒性刺激的激活，ARF转移到核质，通过下调HDM2稳定p53，并激活p53依赖性细胞周期停滞或凋亡。但是NPM突变(NPMc+)却维持与ARF联接能力，在胞质分离。移位到胞质的ARF导致自身部分降解，p53失去稳定性，肿瘤抑制能力减弱，导致肿瘤细胞的异常增殖[13]。另一方面，ARF自身就有抑制核糖体合成、阻止细胞周期的功能，因此它的失活也将导致P53非依赖途径失活,刺激核糖体合成和促进细胞周期进程,使细胞过度增殖[14]。因此，NPM突变可导致抑癌基因ARF和P53的失活，加上致癌基因的刺激，多因素作用促使细胞发生恶性增殖。此外胞质中的NPM1突变蛋白可降低抑癌蛋白生长素应答因子的活性、增强原癌蛋白c-Myc的稳定性，从而发挥促进细胞恶性增殖和抗凋亡作用[15-16]。

3.2 NPM过表达对肿瘤细胞增殖的影响

3.2.1 实体肿瘤中NPM基因往往过表达

细胞以分裂的形式进行增殖，是生物体生长、发育、繁殖、遗传的基础。NPM蛋白在肿瘤及增殖期细胞中的含量约是静止期细胞的20倍。此外NPM1在多种肿瘤细胞中(如胃[17]、结肠[18]、卵巢和前列腺肿瘤[1])过表达，可直接参与肿瘤的发生且NPM1的表达水平与肿瘤发展阶段成正相关，但目前在实体肿瘤中还没有观察到有NPM序列的突变[19]。鄢超等[20]发现NPM1蛋白的阳性表达率在结直肠癌淋巴结转移患者中显著高于无淋巴结转移的患者，淋巴结转移患者的预后往往比无淋巴结转移的患者要差,这些结果提示NPM1蛋白的表达与结直肠癌患者的预后密切相关。雌激素是子宫内膜癌的危险因素，它通过抑制NPM蛋白的泛素化而稳定NPM，并使其表达水平升高，提示NPM与子宫内膜癌存在相关性[21]。PIANTA等[22]通过免疫组化检测发现NPM在甲状腺腺癌和良性滤泡腺瘤均有表达，且在甲状腺腺癌中显著过表达，提示NPM可作为甲状腺癌的早期事件。体外研究[23]表明，NPM基因转染正常成纤维细胞NIH3T3，发现过量NPM能够促进正常细胞恶性转化，体内实验证实高表达NPM的NIH3T3细胞可使裸鼠致瘤。

3.2.2 NPM过表达调控细胞增殖抑制凋亡的可能机制

肿瘤细胞和生长细胞中NPM含量显著高于静止细胞，而凋亡细胞中的表达则下调[24]。虽然还没有直接证据证明NPM的过表达参与了细胞周期的控制，但NPM作为一种抗凋亡蛋白间接参与了相关的机制[25]。抑制细胞凋亡的机制如下:1)在NIH3T3成纤维细胞中，NPM过度表达会导致细胞转化，从而抵抗紫外线诱导的细胞凋亡，并通过上调PCNA和增加DNA修复来维持增殖[26]；2)在缺氧细胞中，NPM可以抑制P53第15位丝氨酸的磷酸化，从而抑制凋亡的发生[27]；3)NPM可以控制ARF的定位并与Mdm2竞争结合ARF，而NPM通过定位核仁和破坏ARF-Mdm2结合来抑制P53活性[28]；4)GURUMURTHY等[29]认为NPM1蛋白是一种HEXIM1结合蛋白(HEXIM1是RNA聚合酶Ⅱ的关键调节因子P-TEFb的抑制蛋白)，对HEXIM1起负调节作用。因此，从这些机制研究中可见，NPM1蛋白的过表达可使RNA聚合酶Ⅱ的转录激活，从而影响细胞增殖。

3.3 NPM基因沉默性表达对肿瘤细胞增殖的影响

NPM基因沉默常常影响细胞周期，其主要表现为促进细胞凋亡。

3.3.1 NPM基因的沉默性表达促进肿瘤细胞的凋亡

余秀琴等[30]的研究表明，siRNA沉默NPM基因表达可显著降低皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖活性，并引起细胞周期停滞，表明细胞生长受到显著抑制。LOBELLO等[3]构建了NPMl-RNAi抗HL-60细胞及其耐药细胞系(HL-60/A DR)的细胞模型，转染后能有效抑制HL-60细胞和HL-60/ADR中NPM蛋白的表达。石静娴[28]的实验结果发现，在调节肿瘤细胞沉默NPM后，通过MMT检测其增强了肿瘤细胞间的粘附能力，降低了迁移能力。这些结果都表明NPM的沉默表达抑制了肿瘤细胞的增殖。

3.3.2 NPM沉默性表达导致凋亡的可能机制

细胞周期的G2/M期阻滞发生在NPM沉默后[28]。AVITABILE等[31]指出NPM沉默表达抑制前RNA合成的产生，引起P53靶基因P21和MDM2的表达，提示NPM在调节rRNA产生和控制P53通路中起重要作用，最终促进细胞凋亡。NPM还下调信号转导和转录激活因子3(STAT3)并抑制细胞增殖[28]。Caspase-3是凋亡早期激活的关键蛋白酶。活性的Caspase-3在肿瘤组织中低表达，加速增殖，抑制凋亡，促进肿瘤的发生发展。有学者研究[28]表明，在人成骨肉瘤细胞MG63中，NPM沉默后，活化的Caspase-3表达上调，促进细胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，表明Caspase家族和Bcl-2家族参与了细胞凋亡的调控。此外，石松林等[32]通过姜黄素诱导食管癌EC9706细胞凋亡，发现姜黄素处理后，NPM穿梭于细胞质中，激活下游促凋亡蛋白，起到加速凋亡过程的作用；NPM可抑制细胞核内相应促凋亡蛋白如p53的活性，维持细胞的存活。

4 小结

NPM在调控细胞周期中起重要作用，NPM突变影响肿瘤细胞的耐药性，NPM高表达往往使肿瘤细胞抑制功能减弱，而出现异常增殖的现象，提示了在早期发现、确诊、预后方面检测NPM蛋白表达的有效性。控制NPM的下调或NPM基因敲除均能引发癌细胞或损伤细胞凋亡。此外，在组织损伤引发的核仁应激反应中，NPM重定位并且也能够引发细胞凋亡。在NPM异常表达对细胞增殖凋亡的调控机制中，P53通路有不可忽略的作用，这为探讨通过NPM控制癌细胞增殖的过程提供了思路。