竞争性内源RNA在食管癌中的研究进展

李春震，冯豪双，陈 岭，赵铁军

(海军军医大学附属长海医院胸外科，上海 200433)

食管癌是一种恶性程度极高的肿瘤，近年来世界范围内的食管癌病例数上升明显，并且我国的食管癌患者数量最为庞大[1],其中大部分为食管鳞癌(ESCC)。尽管近年来手术切除作为食管癌的关键治疗手段取得了一定进展，但由于早期诊断率低、恶性程度高等原因，食管癌患者的5年生存率仍不理想[2]，因此研究有利于实现早诊早治的诊疗模式和检测手段极其重要。在肿瘤的发生发展过程中寻找靶点并进行干预是肿瘤研究的热点方向之一，该过程中存在的蛋白质编码mRNA和非编码RNA的异常，尤其是数量庞大的非编码RNA引起了研究者的广泛关注[3]。非编码RNA主要包括miRNA、lncRNA及cirRNA等，研究已表明这些RNA在结直肠癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]等肿瘤的发生发展及转移等生物学行为中发挥作用，而在食管癌领域这些RNA的功能也在逐步被发掘。

2011年，SALMENA等[3]提出的ceRNA理论为研究RNA在肿瘤生物学行为中的作用提供了新的视角。其主要内容为：含有相同的miRNA应答元件(MREs)的内源性RNA分子，主要包括lncRNA、cirRNA、mRNA及假基因转录物等，可以竞争结合相应miRNA的特定位点实现调节作用，进而在转录后水平调控细胞的生长、增殖和分化等过程。而近年来基于ceRNA理论的食管癌研究取得了一定成果，从RNA-RNA相互作用进而调控下游生物效应的层面加深了人类对食管癌发生发展过程的认识，有望为今后食管癌的早期诊断、治疗和预后评估等方面提供参考。本文就各种类型ceRNA在食管癌的发生发展过程中的作用及食管癌ceRNA网络的研究情况进行综述。

1 lncRNA作为ceRNA在食管癌中的作用

作为基因组中广泛存在的一类长度大于200 bp的非编码RNA，lncRNA具有可顺式和反式调控基因表达的特点，并且在染色质重塑、转录后调控及影响肿瘤的发展进程等方面的功能备受研究者关注[7-8]。大量研究证实了lncRNA失调与肿瘤的生物学行为之间的关系，也证实了选取lncRNA作为食管癌研究的切入点的可行性。YU等[9]对79例食管腺癌(EAC)患者的肿瘤组织样本进行分析，发现有561个癌症相关lncRNA在EAC中的变化高于正常2倍以上(包括上调与下调)，其中包括AC007128.1等12个lncRNAs与总生存期呈负相关，而AC004585.1等在内的14个lncRNAs与总生存期呈正相关。LIU等[10]构建ceRNA网络发现WDFY3-AS2、AC007128.1等8个lncRNAs与生存期相关。SONG等[11]对食管鳞癌(ESCC)的研究也发现了1384个lncRNA的变化，涉及7条上调mRNA的通路和10条下调mRNA的通路，影响肿瘤的细胞分裂周期和信号转导等活动。

YU等[9]在研究中发现lncRNA CYP1B1-AS1和HOTAIR与生存期显著相关，又是ceRNA网络的重要部分，提示两者在研究食管腺癌基因及患者预后方面的重要价值。HOTAIR是一类研究较多的肿瘤发生调节因子，在食管鳞癌组织中高表达并与肿瘤进展和患者的预后密切相关，可作为ceRNA结合miR-125和miR-143正向调节己糖激酶2(HK2)表达，进而发挥致癌作用[12]。此外，CCL18(癌细胞分泌的一种趋化因子)可上调HOTAIR水平，后者靶向作用于miR-130a-5p，导致ZEB1上调，促进食管癌的上皮-间质转化(EMT)与恶性进展[13]。类似的研究也发现LncRNA UCA1[14]、SPRY4-IT1[15]、TUG1[16]、DANCR[17]、NEAT1[18]、TTN-AS1[19]等也在食管癌组织中明显上调并且通过靶向不同的miRNA对下游效应分子产生去抑制作用，进而促进肿瘤增殖及预后恶化。如，LncRNA UCA1作为ceRNA有多个作用靶点，抑制miR-204对Sox4 mRNA的降解，抑制miR-498以增加ZEB2表达，进而促进肿瘤细胞增殖[14,20]。LncRNA DANCR与miR-33a-5p的相互作用也被发现，下游分子ZEB1促进食管癌细胞的增殖和转移，而miR-33a-5p则抑制这种效应，但LncRNA DANCR可作为后者的分子海绵进而上调ZEB1的表达[17]。羧基末端结合蛋白2(CTBP2)是多种肿瘤发生、发展和侵袭等过程的重要调控因子，并且在ESCC组织高度表达，而miR-129可靶向抑制其效应，但lncRNA-NEAT1可解除后者的抑制作用，促进肿瘤进展[18]。lncRNA-XIST通过miR-494/CDK6轴导致食管癌的发生[21]，随后YU等[22]通过构建模块化的ESCC和头颈部鳞癌(HNSCC)的共同ceRNA网络发现，lncRNA-XIST还可能通过miR-6756-5p/C1QA影响患者预后，提示了ESCC和HNSCC在分子层面的潜在联系。lncRNA Snhg1也是通过减轻miR-338-3p对原癌基因CST3的抑制效应来促进细胞增殖，但lncRNA Snhg1与其他分子海绵的不同之处在于其不可降解[23]。YANG等[24]根据lncRNA和mRNA表达谱的差异将ESCC分为2个亚型，分别与miR-186介导的lncRNA-PVT1及miR-26b介导的lncRNA-LINC00240的失调有关，同时lncRNA-PVT1可以作用于miR-203促进肿瘤进展[25]。

基因间长链非编码RNA(LincRNA)作为ceRNA影响细胞功能的研究也逐渐出现，多条调控通路显示了ESCC进展中的ceRNA机制。LINC-ROR可作为miR-145的分子海绵发挥对FSCN1的去抑制作用，且LINC-ROR/miR-145/FSCN1通路参与ESCC的侵袭和转移[26]。LINC01518敲除后miR-1-3p水平上调，进而抑制PIK3CA/Akt通路，降低了鳞癌细胞的致瘤性[27]。LINC00657/miR-615-3p/JunB通路也参与ESCC的侵袭过程，并且LINC00657的上调可能与其放射抗性有关，下调LINC00657可明显提高放疗的敏感度[28]。食管鳞癌患者血浆中LINC00152水平较正常者明显升高，且其水平与食管癌的TNM分期和淋巴结转移等相关，LINC00152/miR-153-3P/FYN通路、LINC01980/miR-190a-5p/MYO5A通路等对ESCC进展的作用也被近期研究所发现[29-30]。

2 circRNA作为ceRNA在食管癌中的作用

circRNA也属于非编码RNA，是一类通过3’端和5’端的共价连接而形成的闭合环状内源性RNA分子，以高度的稳定和保守性在众多物种中广泛存在。circRNA具有可在组织或疾病状态下差异表达、发挥“miRNA海绵”作用并调节转录和翻译过程等特点，也在ceRNA网络中发挥调控miRNA活性的功能[31]。有研究[32-33]发现hsa_circ_0006168、circ-HIPK3的表达与ESCC的TNM分期和淋巴结转移呈正相关，两者均可作为ceRNA结合miRNA发挥调控作用，hsa_circ_0006168结合miR-100调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达，circ-HIPK3通过抑制miR-599进而上调c-myc表达，最终促进ESCC的进展和转移。circ-ITCH的特殊性在于其在ESCC的表达通常较低，但可以通过结合miR-7、miR-17和miR-214等提高ITCH的水平，进而抑制Wnt/β-catenin途径发挥抑癌的作用[34]。化疗耐药是晚期食管癌患者生存率不佳的重要原因之一，ZOU等[35]发现circRNA_001275在顺铂耐药的ESCC中明显升高，circRNA_001275可以与miR-370-3p结合进而上调Wnt7a的表达，促进顺铂耐药。JIANG等[36]构建的circRNA相关ceRNA网络中发现有34个circRNA可结合64个相关miRNA并调节94个mRNA的表达，涉及的靶基因与肿瘤的增殖和转移等过程密切相关。

3 假基因作为ceRNA在食管癌中的作用

假基因具有与正常基因相似的DNA序列，但失去了蛋白质编码功能。其功能在以往未能引起足够的重视，但越来越多的研究[37-38]发现假基因及其转录物在肿瘤发生过程中具有重要调节作用。由于假基因转录物常与同源基因的RNA具备相似MRE，因此可作为ceRNA竞争吸附miRNA发挥下游调控效应。假基因PTENP1与常见的抑癌基因PTEN对应，PTENP1通过竞争miR-17-5p以减少后者对细胞因子信号转导抑制因子(SOCS6)的下调，进而发挥抑制肿瘤生物活性的作用[39]。肿瘤抑制候选基因2(TUSC2)也是新发现的抑癌基因，其假基因为TUSC2P，两者有89%的序列同源并且共享包括miR-17-5p、miR-608等多个miRNA的结合位点，TUSC2P同样可以通过结合上述miRNA调节TUSC2表达，影响肿瘤的生长和侵袭[40]。食管癌组织中PTENP1、TUSC2P的表达水平均明显降低，并且有望作为判断TNM分期、淋巴结转移及患者预后情况的标志物。另外，有研究[41]发现人抑制素基因(PHB)的假基因PHBP1在ESCC中过度表达，其转录物可通过与PHB的mRNA直接作用以促进PHB的表达，进而促进肿瘤进展，虽未发现miRNA参与该过程，但也为研究ESCC中的RNA调控机制提供了新视角。

另外，除了非编码RNA可以作为ceRNA调控生物学功能，具备MRE的蛋白编码mRNA也能在ceRNA网络中发挥作用，并且mRNA的MRE主要位于其3’UTR。肿瘤细胞中具有相同MRE的不同mRNA分子，可通过竞争结合某种miRNA而相互作用，进而对肿瘤细胞的活动实现调节。在乳腺癌[42]、结直肠癌[43]等肿瘤的研究中有部分mRNA作为ceRNA调控其他蛋白表达的报道，但目前在食管癌研究中鲜有报道。但SU等[44]发现在食管癌组织中G6PD的表达明显增高，并且G6PD mRNA的3’UTR可以结合miR-613，逆转miR-613对基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的抑制作用。Sun等[45]发现OTUB1的3’UTR能与miR-542-3p结合，并且OTUB1的表达可以稳定Snail，而当miR-542-3p过表达时Snail也降低，但这些过程是否存在ceRNA机制目前尚不清楚。

4 ceRNA网络与食管癌分子标志物研究

基于ceRNA理论的RNA分子间的相互作用以调控肿瘤的进展和转移等生物学行为的研究为食管癌的诊断和预后评估提供了一个新的思路。既往所建立的多是基于单一RNA分子的预测模型，可能在一定程度上限制了应用效果。如前文所述，多种lncRNA、circRNA等与miRNA及下游的效应分子构成促进或抑制肿瘤进展的调控通路，与肿瘤分期及患者预后等存在明显关联。SHI等[46]建立的基于多类型RNA的ESCC预后评分系统中，纳入包括LINC01068、miR-552-5p、MLIP等多种RNA分子，以及LAN等[47]建立的mRNA-lncRNA预后评估模型，均显示出较单一类型RNA预测模型更优的效果。他们虽然未深入研究这些RNA之间的相互作用，但是提示了利用多种RNA进行预后评估的可行性。CHEN等[48]发现以hsa-miR372为中心的mRNA-CADM2/lncRNA-ADAMTS9 AS2及以hsa-miR145为中心的mRNA-SERPINE/lncRNA-PVT1在食管癌的发生发展中发挥作用，并且联合检测以上ceRNAs能提高诊断的准确率。YU等[9]构建的EAC-ceRNA网络中发现了包括AC007128.1等在内的12个lncRNAs与总生存期呈负相关，而AC004585.1等在内的14个lncRNAs与总生存期呈正相关。类似地，LIU等[10]发现WDFY3-AS2、AC007128.1等8个lncRNAs与患者预后相关。

丰富的生物信息学数据使ceRNA网络的联合应用范围得以延伸，研究者可从更多角度筛选有预测价值的分子标志物。GUAN等[49]联合ceRNA和DNA甲基化相关基因构建了食管癌分子标志物筛选模型，认为RNF217-AS1、HCP5、ZFPM2-AS1和HCG22是与ESCC患者预后相关的关键lncRNA。SHAO等[50]构建了ESCC组织的ceRNA网络和转录因子调节网络，发现了与新辅助放化疗敏感度相关的5个关键miRNA(miR-520a等)、12个lincRNA(APCDD1L-AS1等)以及5个重要转录因子(BMP4等)

5 总结与展望

食管癌的恶性程度高、转移进展快及预后差等特点都提示了开展有利于食管癌的早期诊断和干预相关研究的必要性。从影响肿瘤的发生发展过程的分子通路中寻找干预靶点是重要的研究方向。ceRNA理论揭示了RNA通过竞争结合miRNA实现相互作用并调控下游多种生物效应，进而影响肿瘤进程的新机制。近期众多研究证实了多种RNA分子如lncRNA、circRNA等作为ceRNA调控食管癌的生长、侵袭等生物学过程，一方面显示这些分子具有一定的预后提示意义，更重要的是提供了潜在的治疗靶点。利用生物信息学方法构建ceRNA网络筛选与食管癌预后相关的RNA分子标志物也具有极大的前景。但目前的研究仍存在一定不足，如肿瘤的发生发展涉及的RNA及作用通路众多，当前研究仍处于起步阶段，仍需要大量深入和补充；体外或动物模型的干预实验所取得的成果需要长时间临床转化；ceRNA网络的预测靶点还需要进一步验证等。随着未来研究的深入，ceRNA及其网络的构建有望在食管癌的诊断和治疗中发挥更重要的作用。