乌头的植物和分子系统学——兼论中国附子药用起源的生物学基础

高继海，李曼嘉，张定堃，裴瑾，马云桐，彭成

(成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137)

江油附子是我国典型的道地药材，其道地性一般被认为是生产技术主导型，即江油地区独特的栽培管理和炮制加工技术构成其道地性的主要内涵。江油附子基原植物在品种、品质方面与非道地资源存在明显的差异，自古即认为附子“个大、遵坐正节角少”和“必正节、角少、顶细、脐正者为上”，而“顶粗、有节、多鼠乳者次之，伤缺偏皱者为下”，这种“优形优质”应该是江油附子道地性的生物学基础。近年来，诸多学者尝试从遗传学角度探讨附子道地性的形成机制，但始终未有实质性突破。

系统中药学是中医药现代化阶段的继承和创新性思想，它将中药体系自身、中药的生态环境和中药作用的机体对象均阐释为复杂体系，要认识和研究这3个复杂体系，就必须在复杂系统科学理论和方法的指导下，应用多维评价的方法，探究这些复杂系统及相互间的关键要素、结构、功能和关联，揭示其科学内涵[1-2]。系统中药学为中医药现代化提供了思想支撑，尤其为道地性遗传学机制还未清楚的中药资源研究带来了曙光。本文在系统中药思维指导下，通过梳理多领域和系列交叉学科的研究成果，进行系统性综合，尝试为江油附子的遗传道地性提出研究方向和切入点。

1 乌头的植物系统学

附子入药始载于《神农本草经》，“附乌头而生者为附子，如子附母也”，现代药典将其基原界定于植物学上的乌头(Aconitumcarmichaelii)单一物种，其母根干燥加工品为中药川乌，子根干燥加工品为附子。附子道地性的遗传成因，本质上是乌头的种质形成问题。

1.1 毛茛科植物的亲缘演化

毛茛科传统上被认为是被子植物的原始类群之一，全世界有超60属2 000余种，我国有42属约720种。在APGII系统中，毛茛科植物与小檗科(Berberidaceae)亲缘关系最为接近而成姊妹类群，并依次与领春木科(Eupteleaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、星叶草科(Circaeasteraceae)、木通科(Lardizabalceae)和防己科(Menispermaceae)分化，它们一起归于毛茛目(Ranunaculales)、木兰亚纲(Magnoliidae)。而在毛茛科植物中，分化顺序又依次为白根葵亚科(Glaucidioideae)、白毛茛亚科(Hydrastidoideae)、黄连亚科(Coptidoideae)、唐松草亚科(Thalictroideae)、毛茛亚科(Ranunculoideae)，这些类群在白垩纪后期辐射演化快速形成了几乎所有族的祖先[3-5]。而在族及以下分类单位，毛茛科演化出了难于解析并争议较大的多分支。

1.2 乌头属植物的亲缘演化

乌头属是毛茛科中物种最为丰富的属，全世界约400种，全部分布在北半球，我国发现近170种。乌头属植物根据地下部分划分为3个亚属：牛扁亚属(Subgen.Paraconitum，多年生直根)、露蕊乌头亚属(Subgen.Gymnaconitum，一年生直根)和乌头亚属(Subgen.Aconitum，多年生块根)[6]。

乌头属的外部形态演化大致为：地下部分从多年生到二年生和一年生；叶的分裂程度从小到大，从掌状深裂到掌状全裂，一回裂片从浅裂到细裂；上萼片从船形到盔形、高盔形、圆筒形；花瓣的瓣片从小发展到较大，从分化程度小到分化成明显的唇和由短到长的距；种子表面从平滑到出现膜质横翅。

乌头属的花器官具有典型的自交不亲和特征，主要表现为合子前自交不亲和，而早期近交衰退现象不明显[7-8]。异花授粉、异株授粉均可正常结籽，传粉方式有风媒、虫媒，而以前者为主，植物的居群密度对传粉效率至关重要[9-10]。种子形态有较大的区别[11]，后熟现象严重，通常无法自然萌发。

1.3 乌头的亲缘演化

乌头是本属乃至本科中分布最为广泛、性状最丰富、应用最多的物种[12-13]。除本种乌头外，《中国植物志》中记载的四个亚种，它们的分化尚存争议，但公认乌头属植物在种下水平依然发生着剧烈的分化，其中毛叶乌头(A.carmichaelivar.pubescens)的叶子多毛，黄山乌头(A.carmichaelivar.hwangshanicum)叶片的中央裂片狭长、花序轴常缩短，深裂乌头(A.carmichaelivar.tripartitum)的叶分裂不达基部、叶基部呈宽心形或截状心形，以上三变种的花序和乌头一样都有反曲并贴伏的短柔毛，而展毛乌头(A.carmichaelivar.truppelianum)的花序轴和花梗，以及萼片外面都有开展的直毛。四个亚种间又有过渡类型，如有些展毛乌头与乌头间的过渡类型为花序毛离轴稍展开一点，可没到与轴成直角开展的程度。

叶形是乌头属和乌头下级分类的重要依据[14-16]，也是中药附子品种培育的基础[17-18]。在栽培产地，乌头的叶形品种有南瓜叶、大花叶、小花叶、鹅掌叶、莓叶子、油叶子和冒氏苗等。从传统分类学角度，小花叶(尤其是其中的艾叶形)在进化等级上高于浅裂的瓜叶(尤其是南瓜叶)。

1.4 乌头的地理分布与环境影响

乌头是中国分布最广的属内物种，自川藏高原东缘起向东至长江中、下游以及珠江流域上游各省区的丘陵地区，从江苏向北经过山东到达辽宁南部均有分布，海拔范围达到100～3 000 m之广。附子的栽培地集中在四川、陕西、云南等省区，这些地区的野生乌头既是极为重要的种质资源，又是栽培用种的来源，部分地方还直接入药。

乌头的生境适宜性研究发现四川盆地北部山区、西缘龙门山地和西南山地是广泛的气候生态适宜区，东向盆地中部山丘陵和东部平行岭谷，及西向川西高山高原，气候生态适宜性渐减[17,19]。中国的乌头生态适宜区有十余个省市，相似度95%～100%区域有四川、云南、河南、湖北等省，其中面积较大的区域包括四川省和云南省，面积分别为327 km2和276 km2[20]。通过对种植产区生态因子和栽培方式的研究分析[21]，发现土壤可能是影响乌头分布的主导因素[22]。

2 乌头的分子系统学

2.1 乌头属的分子系统学

自上世纪90年代起，分子系统学在毛茛科的研究中广泛开展，许多分子序列被用于毛茛科分类鉴定，一方面为毛茛科的系统发育研究提供了有效信息，另一方面也给传统分类带来了很多变化。使用过的分子标签有同位酶杂交多态性、RFLP、ISSR、内基因间隔区(cpDNA IGS) 多态性技术、内转录间隔区(ITS)、随机扩增多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、26S，以及叶绿体上的系列基因，以核基因+叶绿体基因的2～3个序列复合使用为主，该方法使人们深入认知了乌头属的系统演化。

乌头属的3个亚属中，分子系统研究表明露蕊乌头亚属应为独立的单系类群，且可能更原始于其他两亚属。牛扁亚属相对乌头亚属较为原始，这与其性状、化学，以及染色体以二倍体为主等特征相符。学者近期甚至发现了牛扁亚属有染色体组基数6的物种(A.fletcheranum)[23]，进一步表明其比染色体组基数为8的其他物种原始。乌头亚属与牛扁亚属植物间的遗传差异并不大，两类群早期可能发生杂交现象，而性状上的较大差异应是近期分化的结果。例如，蓝色花系的乌头亚属与黄色花系的牛扁亚属杂交，演化了大量中间花色的物种[24]。综合分子系统学与地理谱系研究结果[25]，毒虱花属(Staphisagria)植物最早约于渐新世32.3 Ma前从毛茛科翠雀族分化出，然后29.61 Ma前左右露蕊乌头(亚)属形成。乌头属与翠雀属的分支演化约发生于27.24 Ma前，按照各自路线繁衍至今[26]。在乌头属植物一支，约于12.68 Ma前的亚洲地区演化出牛扁亚属、乌头亚属，两者分别于5.27 Ma、7.75 Ma前开始遗传扩张，尤其乌头亚属植物分别于3.3Ma、0.9 Ma向北美和地中海地区发生了扩张事件。

值得注意的是，乌头亚属的染色体倍性较为复杂，呈现出四倍体(2n=32)、六倍体(2n=48)和八倍体(2n=64)混合的现状，其染色体形状、大小与牛扁亚属植物(以二倍体、四倍体为主)有明显区别，这一方面成为两属植物进化关系的评判依据，即乌头亚属具备适应更复杂生境的遗传进化优势，另外也启发了现代分子系统学的研究方向。近年针对乌头属叶绿体基因组比较发现，乌头亚属比牛扁亚属的叶绿体基因组总长度稍小，长序列单拷贝区(LSC)、短序列单拷贝区(SSC)、长片段反向重复序列(IR)结构与蛋白编码基因数量均有趋势性差异[27]。

2.2 乌头的分子系统学

在乌头属内，乌头为分化较晚的物种，与日本乌头(A.japonicum)、卷毛蔓乌头(A.ciliare)、北乌头(A.kusnezoffii，四倍体)聚为一群，向古追溯又依次与蔓乌头(A.volubile，二倍体)、鸭绿乌头(A.jaluense，四倍体)、A.chiisanense、A.austrokoreense、高山乌头(A.monanthum，四倍体)具有亲缘关系[28-30]。叶绿体和核基因两方面的证据都显示蔓乌头(2n=2x=16)参与了东亚乌头属四倍体物种形成，可能是东亚四倍体类群的祖先之一[31]。这种通过杂交产生高倍化物种的现象也发生在牛扁亚属[27,32]。

乌头四个亚种的分类与分化目前尚存争议，但公认其种下水平依然发生着剧烈的分化。毛叶乌头可能存在四倍体和六倍体[8,15]，黄山乌头为四倍体，深裂乌头为四倍体，展毛乌头的倍性不清。通过叶绿体单倍型研究，推测西南地区的乌头原变种可能是由黄山乌头和深裂乌头两个变种杂交而来，黄山乌头为母本提供叶绿体基因组，而深裂乌头为父本，而作为古代道地药材的基原植物，其核心种质可能主指原变种和毛叶乌头[33]。值得中药学者关注的是，高产的八倍体乌头，目前只发现于栽培产区的四川、云南，这两地是中国附子的道地产区，这种道地性的形成与多倍化的演化是否存在相关性，很值得深入探索。

2.3 乌头的遗传多倍化与道地性

乌头属物种均有自然演化的相对固定的生态分布区段，遗传多倍化与耐寒是乌头属演化等级高的特征。综合遗传演化资料，海拔高度与乌头属植物的分布有诸多关联[24]，低海拔区多有二倍体种质，这类植物能够正常结籽和有性繁殖，至高海拔区段则演化为四倍体乃至最高的八倍体。八多倍化演化的结果，使得遗传物质增加，次级代谢产物也更为丰富(药材品质提升)[6,34-35]，适应高寒恶劣生境的能力也提高。

乌头染色体高倍化产生的性状特征，又影响了附子道地栽培技术的形成。在发育问题上，乌头的营养器官更容易培养肥大。在种子问题上，除了自交不亲和普遍规律外[9,36]，多倍化还使得乌头配子发育紊乱的概率提升，导致种子败育[37-39]。在生殖问题上，高倍体物种自然演化出了地下繁殖器官。乌头利用地下根状组织延续物种和居群生存的模式是假一年生(周期为2 年)模式[25]，这是比根状茎(多年生)演化高等的模式[26,34]。传统生理发育研究认为乌头的侧生块根(生附子)实为其更新芽，主要发育自植株的茎基部第一节(叶)位置。然据笔者多年实践栽培发现，乌头在秋冬季茎杆枯死过程中，凡埋土下的多节茎节部位均能发育出侧根，可见其无性繁殖的效率非常高。针对属内其他物种的研究发现，侧生芽(侧根)发育过程中，某些淀粉合成、光合作用、激素调控及转录因子相关的基因共同发挥了重要作用[40]。

因此，笔者认为乌头属乃至毛茛科中只有乌头演化出了八倍体，且其八倍化事件只发生于中国的川西、滇西北地区，以至于被古蜀人民朴素选种为道地种植药材，笔者认为这是破解中药附子道地性遗传机制的切入点，这个观点还有待于深入研究与考证。近年，随着基因组全序列检测成本的加速降低，核基因组与叶绿体基因组正成为系统发育关系研究的有效手段。这种大组学研究的分子系统学数据，反向重复区域都为单拷贝基因，较少受到平行演化和回复突变影响，几乎不会受到旁系同源的影响，能够更真实地反映出物种真实的演化历史，其与植物系统学结合，将成为解决药用植物乌头的生物学起源和中药附子遗传道地性形成的最有效途径。