上感颗粒调节肺炎链球菌感染性肺炎小鼠炎症反应的研究*

李津金 王毅军 芮庆林 王海丹 指导 奚肇庆

（江苏省中医院，江苏 南京 210029）

社区获得性肺炎是医院外获得的，由于病原微生物侵入患者肺实质导致的急性炎症，临床上一般会出现发热、咳嗽、咯痰等症状。肺炎链球菌感染性肺炎是社区获得性肺炎中最常见的一种。江苏省名中医奚肇庆教授基于长期肺系疾病临证经验分析认为：社区获得性肺炎患者大多是由于正气虚亏，表卫不固，不足以抵御外邪，导致外邪入里化热所致。奚肇庆在温热外感发热的理论和辨证方药的基础上，研制出江苏省中医院院内特色制剂上感颗粒，上感颗粒具有于卫分疏解温热之邪的功效。目前，上感颗粒在本院已经常规用于治疗上呼吸道感染，并取得了满意的临床疗效［1-4］。根据上述理论，本课题组将上感颗粒用于治疗肺炎链球菌肺炎小鼠，也取得了令人满意的实验疗效［5］。本实验在前期研究基础上，进一步研究了上感颗粒治疗肺炎链球菌肺炎小鼠的免疫调节机制，为上感颗粒治疗肺炎链球菌感染性肺炎提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级BALB/c小鼠120只，体质量18～22 g，6～8周龄，雌雄各60只。由扬州大学医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（苏）2012-0004。

1.2 试药及仪器 上感颗粒由柴胡（批号：1504018）、黄芩（批号：1501086）、羌活（批号：1502032）、薄荷（批号：1412140）、青蒿（批号：1444097）、生石膏（批号：1407047）、大青叶（批号：1412058）、鸭跖草（批号：1408176）、生甘草（批号：1505106）按比例组成配方，由江阴天江药业有限公司提供。盐酸左氧氟沙星片，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供（批号：14111153）。白细胞介素-2（IL-2）试剂盒（批号：20150706MT）、SIL-2R试剂盒（批号：20150706MU）、白细胞介素-6（IL-6）试剂盒（批号：20150706BH）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（批号：20150712MU），由上海朗顿生物科技有限公司提供。临床分离的肺炎链球菌，由江苏省中医院检验科微生物室提供。超净工作台（苏州净化设备厂）；FA1004电子天平（上海天平厂）；YXQ-2S-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X（济南鑫贝西亚生物技术有限公司）；孵箱（上海分析仪器厂）；SUNRISE酶标仪（瑞士TECAN公司）；AU480全自动生化仪（美国BECKMAN公司）；FACSCanto流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 分组与造模 取BALB/c小鼠随机分成6组，每组20只，分别为正常组、模型组、上感颗粒小剂量组、上感颗粒大剂量组、左氧氟沙星组、上感颗粒大剂量联合左氧氟沙星组（联合组）。按照文献［6］的方法建立肺炎链球菌肺炎小鼠模型。给药前1 d，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，待小鼠进入麻醉状态后，使用1 mL医用无菌注射器针头刺破小鼠鼻黏膜，滴入预先制备的肺炎链球菌菌液50 μL，含菌量3×107CFU［6］。

1.4 给药方法 造模后第2天开始给药，模型组、正常组予等量生理盐水，上感颗粒小、大剂量组分别按28.2、56.4 g/kg给药，左氧氟沙星组按0.249 g/kg给药，联合组予上感颗粒56.4 g/kg+盐酸左氧氟沙星0.249 g/kg。各组给药体积均为0.2 mL/10 g，灌胃给药，每日1次，连续7 d。

1.5 标本采集与检测 1）CD4+、CD8+T细胞：在给药后第3天末、第6天末，各组小鼠眼眶静脉丛取血0.5～1 mL，采血后将血液垂直颠倒混匀，用流式细胞仪进行检测。2）血清IL-2、可溶性白细胞介素-2受体（SIL-2R）、IL-6、TNF-α水平：在给药后第3天末、第6天末，各组小鼠眼眶静脉丛取血0.1 mL，离心取血清，采用双抗夹心酶联免疫吸附法测定。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件。实验数据以（±s）表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+ T细胞水平比较 见表1。给药第3天末，模型组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞、CD4+/CD8+水平与正常组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒小剂量组、大剂量组、联合组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞与模型组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组、联合组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞与左氧氟沙星组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组小鼠外周血中CD4+T细胞与小剂量组比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；联合组小鼠外周血中CD4+T细胞与上感颗粒小剂量组比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

表1 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞水平比较（±s）

表1 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞水平比较（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与左氧氟沙星组比较，■P<0.05；与上感颗粒小剂量组比较，●P<0.05。下同。

组别正常组（n=20）模型组（n=20）左氧氟沙星组（n=20）上感颗粒大剂量组（n=20）上感颗粒小剂量组（n=20）联合组（n=20）时间第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天CD4+T 23.65±3.05*22.15±3.21**56.27±5.71 63.21±4.82 50.71±4.15*43.27±3.39**43.81±3.89*■●31.36±3.46**■●48.39±2.78*39.72±2.83**44.53±3.16*■●31.02±3.87**■●CD8+T 35.56±2.51*36.13±2.72**58.23±4.92 69.52±3.87 49.65±3.27*39.52±4.63**45.92±2.96*■34.29±3.01**■44.32±2.78*6.56±3.76**46.12±2.35*■33.93±2.87**■CD4+/CD8+0.66**0.61**0.96 0.91 1.02 1.09*0.95 0.91 1.09*1.08*0.97 0.91

给药第6天末，模型组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞、CD4+/CD8+水平与正常组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；上感颗粒小剂量组、大剂量组、联合组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞与模型组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；上感颗粒大剂量组、联合组小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞与左氧氟沙星组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组小鼠外周血中CD4+T细胞与小剂量组比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；联合组小鼠外周血中CD4+T细胞与上感颗粒小剂量组比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2 各组小鼠血清IL-2、SIL-2R、IL-6、TNF-α水平比较 见表2。给药第3天末，模型组小鼠血清SIL-2R、IL-6水平与正常组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组、小剂量组、联合组小鼠血清IL-2水平与模型组比较，均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；上感颗粒大剂量组、小剂量组、联合组小鼠血清SIL-2R水平与模型组比较，均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组、小剂量组小鼠血清IL-6水平与模型组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；上感颗粒大剂量组小鼠血清IL-6、TNF-α水平与左氧氟沙星组比较，均明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组小鼠血清TNF-α水平与小剂量组比较，明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。

表2 各组小鼠血清IL-2、SIL-2R、IL-6、TNF-α水平比较（ng/L，±s）

表2 各组小鼠血清IL-2、SIL-2R、IL-6、TNF-α水平比较（ng/L，±s）

images/BZ_59_165_2477_1169_2543.png正常组（n=20）模型组（n=20）左氧氟沙星组（n=20）上感颗粒大剂量组（n=20）上感颗粒小剂量组（n=20）联合组（n=20）第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天43.43±13.05 54.11±6.79*46.21±11.71 45.76±5.17 60.74±6.15*62.55±13.46*66.81±6.85**56.71±9.89*■●68.39±9.48**40.88±13.59■65.50±11.13*62.64±6.86**★5.31±2.01*5.87±1.72 6.23±1.92 4.23±1.31 5.65±1.23*3.35±2.03*4.91±2.56*3.51±1.96*5.12±1.78*4.12±1.98 5.11±1.85*3.29±1.57*★240.0±19.08*202.7±15.13**271.2±28.50 247.7±12.96 247.5±12.89 241.9±21.39 212.4±21.98**■205.0±18.13**■233.4±19.66*197.9±37.13*■258.7±26.77 217.3±34.44■●214.6±20.99 219.9±4.79**221.1±15.39 257.0±23.60 229.9±15.81 194.0±28.16**200.6±29.28■●186.2±15.64**235.0±53.59 198.4±29.97**240.7±36.2 215.2±17.07**

给药第6天末，模型组小鼠血清IL-2水平与正常组比较，明显降低，血清IL-6、TNF-α水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；上感颗粒大剂量组、联合组小鼠血清IL-2水平与模型组比较，均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；上感颗粒大剂量组、小剂量组小鼠血清IL-2水平与左氧氟沙星组比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组小鼠血清IL-2水平与小剂量组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；联合组小鼠血清IL-2水平与上感颗粒小剂量组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组、联合组小鼠血清SIL-2R水平与模型组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；联合组小鼠血清SIL-2R水平与上感颗粒小剂量组比较，明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒小剂量组、大剂量组小鼠血清IL-6水平与模型组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；上感颗粒大剂量组、小剂量组、联合组小鼠血清IL-6水平与左氧氟沙星组比较，均明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；联合组小鼠血清IL-6水平与上感颗粒小剂量组比较，明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；上感颗粒大剂量组、小剂量组、联合组小鼠血清TNF-α水平与模型组比较，均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

机体受细菌毒素、损伤打击后，首先会出现一过性细胞免疫功能降低，使机体对感染易感；其次，机体受到刺激后，体内免疫细胞会被激活，不但会释放大量的促炎介质，引起全身炎症反应综合征，同时也会释放一定量的内源性抗炎介质，抑制炎症反应，形成代偿性抗炎反应综合征；如果机体的炎症反应和抗炎反应保持相对平衡，则机体内环境就能够维持在相对稳定状态，组织、器官功能不会收到明显损伤。一旦全身炎症反应综合征和代偿性抗炎反应综合征失衡，将会引起机体内环境紊乱，导致机体组织器官损伤，严重者甚至发生多脏器功能衰竭。常见的促炎介质，包括肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL-1、IL-6、IL-8）等，主要介导机体炎症反应，导致组织、器官损伤；常见的抗炎介质，包括IL-2、IL-4、IL-10等，主要抑制促炎介质释放，防止过激的炎症反应［7-13］。因此在机体受细菌毒素、损伤打击后，如果能够抑制免疫细胞过度激活，使促炎介质释放减少，抗炎介质释放增加，则能够减少失控的炎症反应对机体造成的损伤。

上感颗粒组分为柴胡、黄芩、羌活、薄荷、青蒿、石膏、大青叶、鸭跖草、生甘草。其中柴胡和黄芩共为君药，柴胡轻清升散，疏邪透表；黄芩苦寒，善清表里之火，一散一清，清解邪热。羌活、薄荷、青蒿、石膏同为臣药，羌活、薄荷合柴胡加强疏邪解表之力，且可避免全方过于寒凉，兼能除湿，为治肢体酸痛之要药；青蒿清热泻火，助黄芩清表里郁热；石膏除烦解肌，泄热。大青叶、鸭跖草则为佐药，共辅黄芩清热解毒，泻火。甘草为使，扶正以助祛邪。上感颗粒组方严谨、灵活，君臣佐使诸药各司其职，使温热之邪疏解于卫分。动物实验表明上感颗粒治疗病毒性肺炎小鼠，主要通过免疫调节机制发挥治疗作用。相关研究显示，上感颗粒能够抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群增殖，导致CD4+/CD8+水平降低，同时抑制TNF-α等炎性介质释放，促进IL-2等抗炎介质释放，维持机体相对的免疫稳态，从而能够减轻过激的炎症反应对组织造成损伤，发挥出良好的治疗作用［14-16］。

本研究结果显示，上感颗粒对肺炎链球菌肺炎小鼠良好的治疗效果，可能是通过免疫调节机制发挥的。在肺炎链球菌感染的第3天和第6天末，模型组的CD4+、CD8+T细胞、CD4+/CD8+水平与正常组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），提示体内免疫细胞被激活；模型组的促炎介质血清IL-6、TNF-α水平与正常组比较明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），提示免疫细胞被激活后，进一步导致促炎介质大量释放。上感颗粒小剂量组、大剂量组、大剂量联合左氧氟沙星组的CD4+、CD8+T细胞与模型组比较，则有不同程度下降，差异具有统计学意义（P<0.05），提示上感颗粒对体内免疫细胞激活有一定的抑制调节作用；模型组的抗炎介质血清IL-2水平与接受上感颗粒治疗的小鼠比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），提示上感颗粒抑制体内免疫细胞过度激活、减少促炎介质释放的同时，还能促进抗炎介质分泌，从而防止过激的炎症反应对肺组织的损伤。接受上感颗粒治疗小鼠的血清SIL-2R与模型组比较，则有明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05），提示上感颗粒可能还通过减少血清SIL-2R合成，进一步导致抗炎介质血清IL-2升高。

在感染的第6天末，上感颗粒小剂量组、大剂量组、联合组的促炎介质血清IL-6、TNF-α水平与模型组比较，明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），而抗炎介质血清IL-2水平与模型组比较，明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。同样提示接受上感颗粒治疗的肺炎小鼠炎症反应比模型组的强度低，造成的肺组织损伤较轻，这与我们前期研究发现一致［5］。

本研究表明上感颗粒对于肺炎链球菌肺炎小鼠的免疫调节作用是其发挥疗效的一个重要机制。上感颗粒可能通过抑制免疫细胞的过度激活，减少炎性介质释放、促进抗炎介质释放，维持机体炎症反应和代偿性抗炎反应之间的相对平衡，从而避免机体过激的炎症反应造成组织、器官发生严重损伤。