五味消痛酊治疗急性闭合性软组织损伤、抗炎、镇痛作用的实验研究*

叶月华 韦 玮 巫繁菁△

（1.广西壮族自治区医疗器械检测中心，广西 南宁 530031；2.广西骨伤医院，广西 南宁530012）

急性闭合性软组织损伤在中医中被称为“伤筋”，属于急性血瘀证的范畴［1］；现代医学认为急性闭合性软组织损伤是创伤引起的无菌性炎症［2］。急性闭合性软组织损伤一般表现为瘀斑、局部疼痛肿胀、功能障碍等，从而影响患者的正常生活。五味消痛酊是广西骨伤医院的自制剂，由五味藤、苏木、山香、桂枝、当归尾、荆芥、紫草、重楼、三七共9种药物组成，具有舒筋活络、消肿止痛的作用，在临床上常用于跌打损伤、软组织肿痛以及运动后的肌肉关节酸痛。本实验通过建立急性闭合性软组织损伤模型大鼠，观察五味消痛酊对于急性闭合性软组织损伤以及镇痛、抗炎的作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠32只，SPF级，雌雄各半，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养级别为SPF级，保证正常光照节律、环境安静、温度适宜，正常大鼠生长繁殖饲料饲养，自由进食和饮水。

1.2 药物与试剂 五味消痛酊（由广西骨伤医院制备，组成：五味藤、苏木、山香、桂枝、归尾、荆芥、紫草、重楼、三七；每100 mL含生药20 g）；扶他林软膏（北京诺华制药有限公司，国药准字H19990291）；PGE-2试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：12/2020）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（上海酶联生物科技有限公司，批号：12/2020）；白细胞介素-1β（IL-1β）（上海酶联生物科技有限公司，批号：12/2020）；白细胞介素-6（IL-6）（上海酶联生物科技有限公司，批号：12/2020）

1.3 仪器 全自动血液黏度动态分析仪South990JK（武汉医盾医疗器械有限公司）；Von frey测痛纤丝（美国North Coast公司）；酶标仪Multiskan FC（赛默飞世尔仪器有限公司）

1.4 模型制备 在造模前1 d以10%硫化钠将大鼠右后肢小腿进行脱毛处理。造模当天将大鼠固定在软组织打击器上，在右后肢小腿中部外侧软组织标记定位，将100 g打击锤拉至10 cm高度，打击标定位置共10次［3］。打击后明显可见打击部位红肿、淤血，提示造模成功。空白组进行脱毛处理但不打击造模。

1.5 分组及给药 将大鼠分为模型对照组、空白对照组、五味消痛酊组、扶他林软膏（阳性对照）组。五味消痛酊组按1 mL/kg给药，每日3次，为弥补药物持续时间短的问题，直接涂抹于患处并覆盖，用纱布与胶布包扎。扶他林软膏组按1 g/kg给药，每日3次，直接涂抹于患处并覆盖，用纱布与胶布包扎。造模当天开始给药，连续给药7 d。

1.6 标本采集与检测 1）损伤症状指数。分别在给药的第1、3、5、7天观察大鼠造模肢体的淤血程度、肿胀程度以及活动情况表现并分级评分。（1）淤血程度：患处暗紫色计2分，暗红色计1分，色泽正常计0分；（2）肿胀程度：肿胀明显计2分，稍有肿胀计1分，无肿胀计0分；（3）活动程度：造模肢体不能行动计2分，造模肢体行动力差计1分，造模肢体行动力正常计0分。2）疼痛缩足反射阈值（PWT）。分别在给药的第1、3、5、7天将大鼠放入底部为金属筛网的玻璃笼中适应5 min，用Von Frey纤毛机械刺激针垂直刺激大鼠造模后肢的足底部中央皮肤，使纤毛机械刺激针弯曲至大鼠出现缩足反应，若未出现缩足反应则换更大强度的纤毛机械刺激针。从2 g强度开始刺激，上限为16 g；每隔15 s刺激1次，每个强度刺激5次出现3次缩足反应时的最小纤毛机械刺激针强度即为PWT［4］。3）血液流变学指标。在第7天末次给药后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/mL）进行麻醉，腹主动脉取血，肝素抗凝，用全自动血黏度分析仪检测大鼠全血高切（150/s）、中切（60/s）、低切（10/s）黏度、血浆黏度和血细胞比容（HCT）。4）损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平。取100 mg损伤组织，用PBS洗去血后剪成小块放入组织研磨器中，加入1 mL PBS制成匀浆，反复冻融2次破坏细胞膜后，将组织匀浆于4℃，5 000 r/min离心15 min。按照ELISA试剂盒说明书操作测定损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS26.00统计软件。服从正态分布则两两比较采用LSD检验，若不符合则用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。图表采用Graph⁃pad Prism 5软件生成。

2 结果

2.1 各组大鼠损伤症状指数的比较 见表1。在给药的第1、3、5、7天观察大鼠造模肢体的淤血程度、肿胀程度以及活动情况表现并分级评分。结果表明在给药的第1、3、5、7天模型对照组与空白对照组具有显著性差异，提示造模成功。在给药第1天，扶他林软膏组、五味消痛酊组与模型对照组相比没有显著性差异。在给药第3、5、7天，与模型对照组相比五味消痛酊组大鼠损伤症状指数显著降低（P<0.01）；在给药第3天，扶他林软膏组大鼠损伤症状指数显著降低（P<0.05），在给药第5、7天扶他林软膏组大鼠损伤症状指数可显著降低（P<0.01）；在给药的第1、3天扶他林软膏组大鼠损伤症状指数较五味消痛酊组稍低，但两组没有显著性差异（P>0.05），在给药的第5、7天五味消痛酊组大鼠损伤症状指数较扶他林软膏组稍低，但两组没有显著差异（P>0.05）。

表1 各组大鼠给药后不同时间点损伤症状指数比较（±s）

表1 各组大鼠给药后不同时间点损伤症状指数比较（±s）

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与空白对照组比较，△△P<0.01。下同。

组别空白对照组模型对照组扶他林软膏组五味消痛酊组n 8 8 8 8第1天0±0 5.50±0.50△△5.25±0.66 5.38±0.86第3天0±0 5.00±0.87△△3.88±0.78*4.00±0.71**第5天0±0 3.38±0.86△△2.25±0.83**2.13±0.93**第7天0±0 2.50±0.50△△0.38±0.48**0.25±0.43**

2.2 各组大鼠PWT水平比较 见表2。在给药第1、3、5、7天，模型组大鼠较空白组大鼠的PWT显著降低（P<0.01）；在给药第1天，虽然五味消痛酊组和扶他林软膏组较模型组大鼠的PWT有所升高但无显著性差异，这可能是由于给药时间较短而造成的；在给药第3、5、7天，五味消痛酊和扶他林软膏PWT均可升高，且与模型组相比具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；在给药的第3、5、7天扶他林软膏组大鼠的PWT值较五味消痛酊组低，但无显著差异（P>0.05）。

表2 各组大鼠给药后不同时间PWT水平比较（g，±s）

表2 各组大鼠给药后不同时间PWT水平比较（g，±s）

images/BZ_56_223_1385_1227_1452.png空白对照组模型对照组扶他林软膏组五味消痛酊组8 8 8 8 12.75±2.33 6.50±1.12△△7.88±1.90 8.13±1.45 12.88±2.20 5.75±1.39△△7.88±1.62*8.75±1.98*13.25±1.79 6.63±2.00△△8.75±1.20*9.38±1.11**12.88±2.26 6.88±1.45△△10.00±2.83*10.63±2.96*

2.3 各组大鼠血液流变学指标的比较 见表3。与空白对照组相比，模型对照组全血低切（10/s）、中切（60/s）、高切（150/s）黏度均显著升高（P<0.01）；与模型对照组相比，五味消痛酊可显著降低全血低切（10/s）、中切（60/s）、高切（150/s）黏度（P<0.01）。与空白对照组相比，模型对照组血浆黏度及血细胞比容显著升高（P<0.01）；与模型对照组相比，五味消痛酊可显著降低血浆黏度和血细胞比容（P<0.01），五味消痛酊组大鼠全血低切（10/s）、中切（60/s）、高切（150/s）黏度，血浆黏度及血细胞比容较扶他林软膏组稍低，但无显著差异（P>0.05）。

表3 各组大鼠全血黏度、血浆黏度与血细胞比容的比较（±s）

表3 各组大鼠全血黏度、血浆黏度与血细胞比容的比较（±s）

组别空白对照组模型对照组扶他林软膏组五味消痛酊组n 8 8 8 8全血黏度（mPa·s）低切14.67±1.33 22.46±1.62△△18.11±1.74**16.72±1.71**中切9.90±1.78 13.75±1.13△△11.88±1.89*11.01±1.78**高切5.47±1.34 8.45±0.96△△6.22±1.01**5.92±0.61**血浆黏度（mPa·s）1.06±0.20 1.55±0.10△△1.25±0.19**1.18±0.17**血细胞比容（%）42.02±3.38 50.93±5.35△△43.27±3.18**42.46±5.31**

2.4 各组大鼠损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的比较 见表4。与空白对照组相比，模型对照组可显著升高大鼠损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平（P<0.01）；与模型对照组相比，五味消痛酊和扶他林软膏可显著降低大鼠损伤组织中PGE-2、TNF-α及IL-1β的表达水平（P<0.05或P<0.01），但IL-6水平均无显著差异（P>0.05）；扶他林软膏组与五味消痛酊组相比，损伤组织中PGE-2、TNF-α及IL-1β的表达水平无显著差异（P>0.05）。

表4 各组大鼠损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平比较（ng/mL，±s）

表4 各组大鼠损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平比较（ng/mL，±s）

images/BZ_56_1310_760_2315_827.png空白对照组模型对照组扶他林软膏组五味消痛酊组8 8 8 8 235.63±38.52 319.48±50.50△△255.04±43.42**271.15±34.45*33.13±6.05 53.24±9.28△△43.95±8.17*41.79±9.44*55.69±6.47 73.00±15.92△△59.55±13.40*67.88±13.72**13.39±2.51 18.31±1.90△△15.65±2.15 14.71±2.98

3 讨 论

闭合性软组织损伤是常见病和多发病，属于中医“伤筋”范畴，《杂病源流犀烛·跌仆闪挫源流》“跌打闪挫，猝然身受，由外及内，气血俱伤”“气滞何处则血凝何处”。《普济方·折伤门》“若因伤折内动经络，血行之道不得宣通。瘀积不散，为肿为痛”。由此可知闭合性软组织损伤的主要病机是气滞血瘀，疼痛和肿胀是其主要临床表现［5］。现代医学研究表明闭合性软组织损伤是在组织受伤后出现细胞死亡、出血、凝血等现象，随即触发炎症反应，出现红肿、淤血、疼痛、行动力降低等临床表现［6］。炎症反应伴随着组织损伤的发生而发展，PGE-2是花生四烯酸代谢途径的产物，可协同趋化因子、增强血管通透性，从而吸引中性粒细胞引起发热，参与痛觉产生引发炎症损伤［7］；TNF-α是重要的炎症介质，可激活p38-MAPK通路，改变细胞膜通透性，使Na+内流，降低兴奋性阈值，产生痛觉，组织损伤［8］；IL-1β与IL-6可激炎症介质传递和细胞因子产生，进而引起组织损伤［9］。五味消痛酊可以改善急性闭合性软组织损伤大鼠的淤血程度、肿胀程度，改善损伤后肢的行动力；可以降低全血黏度、血浆黏度、血细胞比容，改善局部淤血；可以提高损伤大鼠的疼痛缩足反射阈值，发挥镇痛的作用；同时通过降低大鼠损伤组织中PGE-2、TNF-α、IL-1β的表达水平进而改善炎症引起的组织损伤。

五味消痛酊方中五味藤、苏木、三七具有消肿止痛、活血散瘀的功效。现代研究表明五味藤有抗炎止痛的作用［10］。苏木具有较强的抗炎、血管舒张等药理活性［11］。三七具有活血与止血双向调节和抗炎的作用，三七素为三七中主要的止血成分，三七黄酮为主要活血抗炎成分［12］。归尾活血，有祛瘀而不伤血之妙，在当归的3个部位中，归尾中阿魏酸的含量最高，阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓等药理作用［13］。山香可行气散瘀，现代研究表明山香具有镇痛、抗炎和伤口愈合的作用［14］。桂枝具有温通经脉、通阳化气之功效，表现出改善微循环、抗炎、抗血小板凝集等多种生理活性［15］。荆芥、重楼具有抗炎、镇痛、止血的作用［16-17］。紫草可清热解毒、凉血止血，具有抗炎等药理活性［18］。五味消痛酊为酊剂，局部用药时通过创伤表面经皮吸收，避免肝脏的首过效应，保持局部的血药浓度，对于治疗急性闭合性软组织损伤具有一定优势。五味消痛酊既可起到镇痛作用，通过治标解决患者的疼痛，又可以通过改善血液流变学，抗炎进而治本。

综上所述，五味消痛酊对于急性闭合性软组织损伤具有一定治疗作用，提高大鼠的疼痛阈值，并且可通过降低PGE-2、TNF-α、IL-1β的表达水平改善炎症引起的组织损伤。本实验对五味消痛酊的抗炎、镇痛以及对于急性闭合性软组织损伤的治疗作用进行了一定的研究，为后续更深入的作用机制研究以及活性成分的寻找奠定了一定的基础。