健脾清热活血方介导keap-1-Nrf2信号调控claudin-2表达干预溃疡性结肠炎模型大鼠实验研究*

罗淑娟 陈小芬 林逸婷 卢 鑫 张 涛

（1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530222；2.广西中医药大学，广西 南宁530011；3.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

本课题组前期临床研究证实，健脾清热活血方具有明确缓解轻度溃疡性结肠炎（UC）效用，其疗效与艾迪莎相仿，对于中度UC患者配合激素使用，亦有辅助作用［1］。动物实验发现健脾清热活血方具有促进黏膜屏障修复，诱导炎症缓解的效用，但其具体的机制还有待深入研究［2］。UC发病机制与氧自由基产生过多及脂质过氧化有密切关系，血管活性因子即肠源性缩血管物质活性增强，导致肠道缺血，同时结肠黏膜中的炎性细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等经血液循环浸润到肠道的黏膜层、黏膜下层，引起肠黏膜受损。在还原性辅酶Ⅱ、NADPH氧化酶以及呼吸作用下产生大量脂质过氧化物如O2-、OH-等，这些物质进一步加重肠黏膜损伤［3-5］。keap-1-Nrf2路径是机体最主要的抗氧化应激反应通路之一，在促进黏膜修复、诱导细胞凋亡、降低炎症反应等多方面发挥重要的生物学作用，但健脾清热活血方是否通过介导keap-1-Nrf2通路调控clau⁃din-2表达而发挥其防治UC的效应尚不清楚。本研究应用三硝基苯磺酸（TNBs）制备UC模型，将健脾清热活血方作用于上述模型，应用现代生物学技术检测结肠组织病理学、超微结构、环氧氯丙烷结合蛋白1（ke⁃ap-1）、Nrf2以及claudin-2表达变化，客观评价健脾清热活血方的效用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只SPF级雄性SD大鼠，体质量150～180 g，购自广西医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证：SCXK（桂）2014-02。所有动物实验均在广西中医药大学实验动物中心完成，许可证号：SYXK（桂）2018-0012。动物饲养在恒温房间（21～23℃），每隔12 h光暗循环，自由进食进水，适应性喂养1周后开始实验。所有实验均符合动物3R福利原则。

1.2 试剂及仪器 5%2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS）购自美国SIGMA公司（货号：P2297），10%中性甲醛、戊二醛、无水乙醇购于广西博仁生物试剂有限公司；Anti-keap-1、Anti-Nrf2以及Anti-claudin-2均购自美国 Abcam 公司（货号：ab119403，ab31163，ab53032），辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德公司（货号：GA1014），EDTA缓冲液（博士德，SN109）；伊红（中杉，S133）、苏木素（中杉，S130）、DAB显色试剂盒（中杉，SB1030），免疫组化湿盒（抗体孵育用），BX43F电子显微镜（日本OLYMPUS）、透射电镜（日本日立H7650）等。

1.3 实验药物 健脾清热活血方（马齿苋15 g，白术10 g，白芍15 g，水蛭10 g，三七10 g，救必应15 g，炙甘草6 g。用蒸馏水煎煮药液，浓缩至含生药1 g/1.5 mL，过滤分装4℃保存备用）。美沙拉嗪（商品名艾迪莎），500 mg/袋，法国爱的发制药集团生产，国药准字H20040727。药物均购自广西中医药大学附属瑞康医院药房。

1.4 分组与造模 将90只大鼠按体质量随机分为6组，即正常组、模型组、西药组和中药低、中、高剂量组，每组15只。参照文献报道［6］，正常组除外，其余各组均采用TNBS 100 mg/kg+50%乙醇法灌肠法制备UC模型，连续灌肠3 d，休息4 d。

1.5 给药方法 造模开始第7日起，模型组予等剂量生理盐水灌胃，中药低、中、高剂量组予健脾清热活血方4.29、8.58、17.16 g/kg灌胃（成人用药量的3、6、12倍，即实验动物与人按体表面积比等效剂量换算，将每天剂量折算成大鼠等效剂量作为中剂量组），西药组予美沙拉嗪灌胃（0.4 g/kg），正常组同步饲养。连续给药14 d。

1.6 标本采集与检测 1）大鼠一般情况。观察各组大鼠毛发、体质量、耗食耗水、大便、死亡情况。2）结肠组织病理学变化。末次给药后予10%水合氯醛腹腔注射麻醉处死全部大鼠，截取距肛门8 cm处病变部位，沿纵轴切开，分别置于中性甲醛、戊二醛及液氮中备测，肉眼下放大镜观察结肠溃疡及其糜烂情况。3）HE染色检测各组UC大鼠结肠组织病理改变。具体步骤严格按说明操作，在光镜下观察标本病理学改变并摄片。4）大鼠结肠黏膜超微结构变化。采用H-7650透射电镜检测各组UC大鼠结肠黏膜超微结构及细胞凋亡变化。5）结肠keap-1、Nrf2以及claudin-2蛋白表达。采用免疫组化检测，具体步骤严格按试剂盒说明操作，由两名病理专业人员采用Image Pro Plus 6.0进行图像分析。以细胞呈棕褐色染色为阳性结果，对照组采用PBS代替一抗。

1.7 统计学处理 应用SPSS24.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态分布资料采用单因素方差分析检验；若为非正态分布资料采用秩和检验来比较两组间差异。P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 正常组同步生长，造模期间各组均未见大鼠死亡，自造模第2日起可见大鼠肛门污秽、有血便残留、食欲下降，皮毛稀疏无光泽，体质量无明显下降。肉眼下用放大镜观察见距肛门8～12 cm处病变最为明显，部分糜烂表面附着少许黄白苔，予标记后送检病理。

2.2 各组大鼠结肠组织病理学改变 光镜下见正常组结肠黏膜排列整齐，未见炎性细胞浸润；模型组见结肠黏膜表面出现缺损或脱落坏死，溃疡形成，隐窝结构消失、脓肿形成，固有层大量炎性细胞浸润，黏膜下层充血肿胀；西药组见结肠黏膜不同程度缺损，溃疡形成，隐窝脓肿，黏膜下层大量炎性细胞浸润；中药各组见结肠黏膜尚完整，但存在黏膜缺损，隐窝脓肿，部分可见出血点，较多炎性细胞浸润固有层。见图1。

图1 各组UC大鼠黏膜组织病理学改变（HE染色，10倍）

2.3 各组大鼠结肠黏膜超微结构及细胞凋亡情况电镜下见正常组结肠上皮细胞单层柱状排列，微绒毛发达密集，整齐排列，未见细胞坏死和凋亡；模型组结肠上皮细胞微绒毛稀疏，线粒体肿胀变大，细胞间紧密连接消失，可见细胞处于坏死期；西药组见上皮细胞单层柱状排列，但排列欠整齐、线粒体肿胀、凋亡小体形成，局灶可见坏死；中药各组见上皮细胞体积明显变小、核固缩、凋亡小体形成，局灶可见坏死。见图2。

图2 各组UC大鼠电镜下结肠黏膜超微结构及细胞凋亡（8 000倍）

2.4 各组大鼠结肠keap-1、Nrf2以及claudin-2蛋白表达比较 与正常组比较，模型组结肠Keap-1、Nrf2蛋白表达下降，claudin-2蛋白表达上升。与模型组比较，各给药组Keap-1、Nrf2蛋白表达上升，claudin-2蛋白表达下降，但西药组与模型组之间无统计学差异（P>0.05），中药各剂量组与模型组、西药组比较有统计学差异（P<0.05），中药低、中、高剂量组之间不存在组间差异（P>0.05）。见图3～图5，表1。

表1 各组大鼠结肠黏膜keap-1、Nrf2、claudin-2蛋白表达比较（IOD，±s）

表1 各组大鼠结肠黏膜keap-1、Nrf2、claudin-2蛋白表达比较（IOD，±s）

注：与模型组比较，*P<0.05；与西药组比较，△P<0.05。

组别正常组模型组西药组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 6 6 6 6 6 6 keap-1 6 543.92±834.83*3 352.83±833.96 3 907.27±718.01 5 412.21±622.25*△5 793.00±693.49*△5 864.43±793.03*△Nrf2 8 163.03±318.04*4 517.53±909.53 4 568.19±712.11 5 123.03±678.04*△6 578.62±634.39*△6 907.57±718.51*△claudin-2 3 352.83±633.96*8 533.08±659.29 8 413.49±617.34 6 426.86±818.79*△6 336.08±698.27*△6 123.49±578.24*△

图3 各组UC大鼠结肠keap-1蛋白表达（10倍）

图4 各组UC大鼠结肠Nrf2蛋白表达（10倍）

图5 各组UC大鼠结肠claudin-2蛋白表达（10倍）

3 讨论

本课题组在中医药理论指导下，传承全国名老中医胡珂、谢建群、马贵同等教授临证经验，指出溃结当以“脾虚为本，湿热瘀毒为标”为基本特点。脾虚无以运化水液，聚湿成痰，痰随气而升无处不致，日久阻塞经络，化为瘀血，痰瘀互结，损伤肠络；而溃结之所以反复发作，其关键在于“湿”“热”“瘀”之邪留于体内，没有得到彻底根除，每遇外感或内伤的诱因而复发，如“邪气或动或静，其痢乍发乍止”，由此提出“健脾清热活血”的基本大法。

基于“提高UC黏膜愈合质量是减少UC复发关键所在”的理念［6-7］，本研究从氧化应激介导炎症持续角度出发，探讨健脾清热活血方介导keap-1-Nrf2通路调控claudin-2表达干预溃疡性结肠炎的机制研究。健脾清热活血方主要由救必应、马齿苋、白术、白芍、水蛭、三七、炙甘草等药物组成，以救必应泻火解毒、清热利湿、行气止痛、凉血止血，归于大肠经，直抵病所为君药，马齿苋、水蛭、三七活血化瘀、祛腐生新为臣，佐以白术健脾益胃、燥湿和中，芍药甘草缓急止痛，全方共奏清热活血、健脾和胃之功效。笔者通过组织病理学证实与模型组比较，治疗组所见黏膜损伤程度较模型组有不同程度改善，部分可见出血点，较多炎性细胞浸润固有层。表明健脾清热活血方药具有减少组织损伤、促进修复黏膜、缓解溃结炎症，防治溃疡性结肠炎的效用。

反复炎症刺激形成氧化应激产生的线粒体内的活性氧（ROS）爆发直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础［8］。keap-1-Nrf2-ARE路径是机体最主要的抗氧化应激反应通路之一，参与机体炎癌转化、细胞凋亡、炎症反应及黏膜修复等多方面［9］。Nrf2属于CNC转录因子家族成员之一，广泛存在于机体多个组织器官中，Kelch样环氧氯丙烷结合蛋白1（keap 1）是Nrf2的重要受体，生理状态下，Nrf2位于细胞质中，与keap 1结合，处于被抑制状态，当受到氧化应激信号刺激后，Nrf2迅速与变构的keap 1解耦连，以稳定状态转位进入细胞核，与小Maf蛋白结合形成异二聚物，并与一顺式作用元件即抗氧化反应元件（ARE）结合，结合ARE上的GCTGAGTCA位点，参与下游一系列Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的转录与调控。ARE是一个特异的DNA启动子结合序列，位于所调控的抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的5′端启动序列［10-11］。Claudin蛋白家族作为反映肠黏膜屏障最重要的生物标记物，在维护肠黏膜屏障完整中发挥重要的生物学作用［12］。claudin蛋白是构成紧密连接复合体的主要骨架，不同的claudin分子对紧密连接的通透性有不同的影响。一部分claudin分子可以形成特异性离子通道而增加上皮、内皮通透性，称为“leaking”claudin，包括claudin-2、claudin-10等［13-14］。本研究发现模型组 keap-1、Nrf2蛋白表达明显下降，claudin-2蛋白表达上升，说明UC炎症持续会导致体内抗氧化应激水平下降，导致细胞内ROS爆发、超载，导致细胞坏死、损伤，加重炎症的进程，甚至异型增生。同时也反映肠上皮通透性增加，由此可能造成大量的抗原通过受损肠黏膜屏障渗入肠道内，与食物抗原交互反应而导致炎症持续，导致靶器官受损。治疗后，治疗组keap-1、Nrf2蛋白表达上升，claudin-2蛋白表达下降，说明健脾清热活血方可能通过促进机体内源性的反应性氧化应激的清除而达到缓解炎症的效用。

总的来说，本次研究初步证实健脾清热活血方通过上调keap-1、Nrf2表达，下调claudin-2表达，修复黏膜屏障减少抗原刺激而发挥防治UC的效用。