酶工程技术在茶叶方面的应用研究进展

武珊珊 丁其欢 周雪芳 马占霞 杨雪梅 邵宛芳 苏建美

(1 滇西应用技术大学普洱茶学院 云南省普洱市 665000;2 云南省绿色食品发展中心 云南省昆明市 650000)

酶工程是于1971 年第一届国际酶工程会议上首次命名的一项技术，即将酶学基本原理与化学工程技术及基因工程有机结合形成的新型应用技术，是基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程以外的现代五大生物工程技术之一，主要研究酶的生产纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰与改造等，在工农业、医药卫生等领域广泛应用。酶是一种结构复杂且精巧的生物催化剂，具有催化效率高、专一性强的特点，其功能受到各种物理化学因子的影响和调控［1］。

茶作为一种天然饮品，茶树生长发育、茶叶加工制造、茶叶深加工、茶叶检测等都与酶的作用密不可分。随着酶工程技术的发展，通过改变酶活性调控茶树代谢、制茶品质提升、茶叶深加工应用等方面的研究日益增多。茶鲜叶中的酶类很复杂，常见的为氧化还原酶类和水解酶类，如多酚氧化酶、过氧化物酶、醇脱氢酶、脂肪氧合酶、叶绿素酶、单宁酶、糖苷酶、纤维素酶、果胶酶等，在茶树代谢、茶叶深加工等方面，对于初级及次级代谢产物的变化、茶叶品质的形成等有重要的调节作用［2］。

1 茶叶中酶的获取

天然酶可通过从动植物细胞中直接提取、微生物发酵生产、化学合成等方式获取。李荣林等［3］从茶树鲜叶中提取了多酚氧化酶，并开展了酶的包埋交联固定化研究。李立祥等［4］试验通过采用浸提法、不同缓冲溶液匀浆法、丙酮粉法等不同方法，从茶鲜叶中提取了多酚氧化酶，并比较了不同酶提取方法对酶活力的影响。孔俊豪等［5］开展了从冻存茶鲜叶中提取多酚氧化酶的实验，并研究了酶动力学特性。速晓娟［6］从茶鲜叶中提取了粗酶液，并添加应用于黄茶加工过程中，结果显示出较好的酶促黄变作用效果。张冬莲［7］等应用宏蛋白组学技术，从普洱茶熟茶发酵阶段样品中提取了微生物胞外酶，并依此建立了适用的提取方法。

2 酶在茶叶初加工中的应用

以茶鲜叶为原料，在不同的工艺条件下，内含物质在酶的作用下发生理化变化的过程，即为茶叶初加工，又称为茶叶初制过程。随着酶工程技术的发展，外源酶近年来多用于添加在各类茶叶的初加工过程中，如纤维素酶、蛋白酶、单宁酶等单一酶或组合酶，在改善夏茶品质，优化茶叶原有的香气与滋味，提升茶叶品质方面得到了广泛应用。

2.1 酶在茶鲜叶处理的应用

袁林颖等［8］研究证实，可通过对茶鲜叶进行超高压加工技术处理，降低多酚氧化酶活性，有助于后续绿茶制作品质的提升。Takeo等［9］首次提出，茶鲜叶中的葡萄糖苷酶可水解糖苷物质，释放出芳樟醇、香叶醇等香气物质，对于成茶香气的形成有重要的作用。范仕胜等［10］研究发现，茶鲜叶经人工光源处理后，β-葡萄糖苷酶与多酚氧化酶活性均提高，可促进品质成分的变化及香气的提高。金心怡等［11］通过远红外与日光两种不同萎凋方式的对比试验，证实远红外萎凋叶的各酶活性强于日光萎凋叶。

2.2 外源酶在绿茶初加工中的应用

汪珈慧等［12］以壳聚糖作为载体，戊二醛为交联剂制备固定化纤维素酶，对夏季绿茶进行酶解，研究出最佳绿茶制作工艺。冯云［13］通过在绿茶夏茶加工过程中添加木瓜蛋白酶、单宁酶、纤维素酶后，分别提高了茶汤的鲜爽度、降低了苦涩度、增加了甜度，总体提升了绿茶夏茶的品质。夏进伟等［14］研究通过在云南大叶种下叉烘青的揉捻过程中，喷施木瓜蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶，结果显示夏茶品质得到明显提高。

2.3 外源酶在红茶初加工的应用

罗晶晶等［15-16］通过在萎凋过程中添加外源纤维素酶、木聚糖酶及木瓜蛋白酶，探讨了不同外源酶对夏季金观音红茶及英红九号红茶内含成分的影响。曾晓雄［17］试验表明，在红碎茶加工中添加蛋白酶，可使香气变好、汤色变亮、滋味增强。谭振初等［18］在红碎茶加工过程中，添加了从茶幼果提取的多酚氧化酶，发现茶黄素含量明显提高，红碎茶品质显著提升。

2.4 外源酶在青茶初加工的应用

肖世青［19］发现，可在铁观音夏茶初制的摇青工艺后或初烘工艺前添加蛋白酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、漆酶或复合酶等外源酶，证实漆酶与β-葡萄糖苷酶可改善夏茶铁观音的香气与滋味。张雪波［20］试验发现，适当浓度和比例的漆酶与α-半乳糖苷酶处理可明显改善安溪铁观音暑茶品质。肖安风［21］利用固态发酵的单宁酶二次加工低档铁观音干茶，显著提升了原有品质。

2.5 外源酶在黑茶初加工的应用

赵熙等［22］通过在黑毛茶渥堆过程中添加纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶的试验，可使黑毛茶的多酚类、可溶性糖、水浸出物等物质含量提高，使黑毛茶的滋味趋于醇厚。聂枞宁［23］证实，在黑毛茶渥堆过程中添加土豆外源酶，可缩短加工时长，并提高四川黑茶的风味品质。张芬等［24］通过在六堡茶的渥堆过程中添加纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和过氧化物酶，研究了外源酶对六堡茶主要物质转化规律的影响。赵冰等［25］用苹果、梨、香蕉外源多酚氧化酶对普洱茶进行酶促处理后，发现可促进茶叶内部化学成分的氧化聚合，茶褐素含量明显增加，而茶多酚、儿茶素、水浸出物与茶黄素的成分的变化与酶活力存在极显著的负相关性。雷林超等［26］在晒青毛茶发酵过程中，通过添加阿魏酸酯酶与木聚糖酶，并以高效液相法测定的内含物质含量的变化为指标，证实酶处理有利于增加普洱茶的附加值。杨富亚等［27］在普洱茶渥堆过程中联合应用多酚氧化酶、多糖水解酶类、单宁酶、蛋白酶等制成的复合酶制剂，可一定程度上增加水浸出物、茶多酚、可溶性糖的含量，简化渥堆工艺，使普洱茶品质得到综合提升。

2.6 外源酶在白茶初加工的应用

邱丽玲［28］在不同季节的福鼎白茶鲜叶原料中添加酶制剂组合的研究认为，得出酶处理可明显改善白茶品质的结论。张艳梅等［29］在特异茶树品种紫娟白茶初制萎凋过程中添加脂肪酶，并加以轻微包揉、发酵，结果显示促进了白茶品质的提升。

2.7 外源酶在黄茶初加工的应用

速晓娟［6］将茶鲜叶酶添加在黄茶的杀青及揉捻过程中的试验，显示酶液有效促进了酶促黄变，改善了原有闷黄技术的进程。

3 酶在茶叶深加工的应用

茶叶深加工指以茶鲜叶、成品茶、副茶等为原料，采用相应的物理、化学和生物技术生产出含茶或茶有效成分的新产品的加工过程。茶叶深加工也是有效解决中低档茶出路、提升茶叶附加值、拓展茶叶应用领域、延伸茶叶产业链的重要途径。

3.1 酶在速溶茶、茶膏加工的应用

速溶茶生产中，可通过添加单宁酶、蛋白酶、果胶酶等酶水解酯型儿茶素去除部分茶多酚，而降低苦涩度、减少茶乳酪形成，增强速溶茶的冷溶性与澄清度。Philip 等［30］通过将细碎的鲜茶叶进行单宁酶处理，获得了速溶茶。钟艳梅等［31］以低档绿茶为原料，对其水提液添加外源过氧化氢酶进行液态发酵，酶促转化成红茶茶汤，为研究优质速溶红茶提供了依据。尚楠［32］通过采用蛋白酶、纤维素酶和果胶酶复合酶处理安吉白茶片茶汤，制作出高氨基酸速溶白茶。方可等［33-34］通过将β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶添加在速溶绿茶粉乌龙茶粉水溶液的试验，证实β-葡萄糖苷酶可显著改变2 种速溶茶粉水溶液的香气，且α-L-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶对增强速溶绿茶粉水溶液的青草香具有协同增效作用。潘斐［35］研究发现，以氨基酸、茶多糖、茶多酚含量变化为指标，当添加的植物水解酶浓度为0.6%时，普洱茶膏感官品质最优。

3.2 酶在茶饮料加工的应用

酶技术在茶叶浸提、过滤与澄清、转溶等茶饮料生产工艺中得到广泛应用。Takino 等［36］最早应用单宁酶，以减少茶汤中茶乳酪的形成，最终达到茶饮料澄清的效果。饶建平［37］实验以绿茶（龙井）为原料，采用壳聚糖为载体固定化单宁酶来澄清茶汤。许勇泉等［38］通过添加单宁酶水解酯型儿茶素的试验，研究探讨单宁酶处理对绿茶茶汤的沉淀复溶和回收利用的影响。郑宝东等［39］利用蛋白酶-果胶酶复合酶处理茶汤后，结果显示茶汤滋味及膜过滤通量均优于单独酶处理。钟艳梅等［40］利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶对红茶茶汤进行沉淀澄清试验，研究表明这2种酶处理均能显著提高茶汤透光率，起到澄清作用。苏二正等［41］应用单宁酶与β-葡萄糖苷酶的共固定化酶技术处理后，茶饮料的除混与增香方面显示出良好的效果。多试验结果表明，果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶作用于乌龙茶、绿茶、红茶等茶汤后，芳樟醇、香叶醇等香气成分增加，茶汤香气得到显著提升［42-44］。李平等［45］将黑曲霉中提取的β-葡萄糖苷酶应用于果汁、茶汁、果酒等饮品，显示出较好的增香效果。郭昊蔚［46］实验证实，绿茶茶汤经果胶酶和纤维素酶处理后，茶饮料色泽及滋味均得到改善。

3.3 酶在茶叶天然产物提取与合成的应用

茶叶中含有茶多酚、茶色素、茶多糖、茶皂素等多种具有生物活性的天然产物，近些年来，学者对其生理学功能进行了广泛而深入的研究，但茶叶天然产物含量较低、较难直接提取，酶工程技术作为新型生物工程技术，被广泛应用于茶叶天然产物的提取与合成领域。

3.3.1 酶在茶叶天然产物提取的应用

杨文雄［47］以红茶为研究对象，采用酶技术和超微粉碎技术对红茶的静态、动态萃取和萃取动力学过程进行了系统研究，并比较了不同方式萃取红茶后的茶汤品质的优劣，探讨了红茶萃取的因素。刘菁等［48］利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶单一酶或其复合酶处理茶树老叶后，茶多酚、茶多糖、氨基酸等风味物质含量得到显著提高。杨刘艳等［49］以粒径为0.63 mm 的茶叶为原料，研究复合酶辅助提取法，结果表明复合酶（纤维素酶和果胶酶）对有效成分的提取效果较好，且条件温和、操作简便。谭淑宜等［50］试验证实经0.3%的纤维素酶或0.8%的蛋白水解酶处理后绿茶和红碎茶水浸出物提取率可提高20%。Chandini 等［51］在茶叶提取试验过程中添加果胶酶，发现水浸出物含量相对增加了11.5%。

郑生宏等［52］采用纤维素酶+果胶酶的复合酶法研究了辅助浸提绿茶多酚的最佳工艺。谢蓝华等［53］以单枞茶为实验材料，研究了复合酶解辅助乙醇提取茶多酚的工艺条件。王岩岩等［54］采用纤维素酶处理绿茶茶汤，试验结果显示茶多酚提取率上升14.17%。程琦等［55］以壳聚糖为载体对单宁酶进行固定化，研究了酯型儿茶素的水解反应。王佛生等［56］应用马铃薯作为多酚氧化酶（PPO）的酶源进行了酯型茶黄素酶促氧化的制备研究。

张婷婷等［57］通过在武夷岩茶粗老茶叶制作中添加木瓜蛋白酶和纤维素酶辅助浸提的试验，确定高含量游离氨基酸水提液的最佳浸提工艺参数。靳伟刚等［58］在茶叶蛋白提取试验中采用新的复合酶酶法提取工艺，使蛋白提取率和蛋白纯度都有了较大的提高。谭晓妍等［59］以茶渣为原料，研究优化了碱性电解水耦合酶提取茶渣蛋白的工艺。

金友兰等［60］以绿茶水提茶渣为原料，试验结果证实，辐照预处理辅助纤维素酶水解绿茶水提茶渣的工艺有利于水溶性糖的制备。高仁金等［61］采用超声波辅助纤维素酶提取茶叶废料中的茶多糖，并以含量作为指标，通过正交实验优化茶多糖的提取工艺。陈文娟等［62］利用蜗牛酶辅助提取白芽奇兰茶多糖，并对酶解提取工艺进行响应面优化。

王晓琴［63］采用纤维素酶开展茶叶籽油水酶法提取茶皂素工艺研究，茶皂素提取率高达6.8%。游瑞云等［64］采用淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶对茶皂素进行纯化水解的工艺研究。王娅玲等［65］利用超声辅助纤维素酶法进行了茶粕中茶皂苷的提取工艺研究。刘洁等［66］以夏秋季都匀毛尖为原料，利用纤维素酶和果胶酶辅助提取低档毛尖茶中总黄酮。杨宇华等［67］以冲泡后的武夷岩茶茶渣为原料，以α-淀粉酶粗制、木瓜蛋白酶精制获取了膳食纤维，并确定了最佳提取条件。Zheng等［68］以“交联-包埋-交联”固定化酶技术将β-葡萄糖苷酶固定于海藻酸盐，研究表明绿茶、乌龙茶和红茶中的芳香性物质成分总量得到显著提高，固定化β-葡萄糖苷酶可实现连续提取后回收。

3.3.2 酶在茶叶天然产物合成的应用

儿茶素作为茶叶中茶多酚的主体成分，被证实其生理活性较强，但因其溶解性、稳定性等问题导致在体内生物利用度不高，研究显示通过酶法对其分子进行酰基化、糖苷化等化学修饰得到的儿茶素产物可最大化保持儿茶素的生物活性［69-70］。薛金金等［71］利用丰水梨等植物源多酚氧化酶进行了氧化儿茶素合成茶黄素和聚酯型儿茶素的研究。吴光亮等［72］利用皇冠梨多酚氧化酶催化表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯合成茶黄素双没食子酸酯。丁兆堂等［73］通过纳米碳酸钙固定化酶，进行了体外制备茶黄素。王斌等［74］研究了填充床反应器上固定化漆酶连续氧化茶多酚制备茶黄素，自制了连续化制备茶黄素的填充床生物反应器，为茶黄素的制备提供一种可行的连续化方法。王挥［75］以黑曲霉菌株为产单宁酶的出发菌株，采用紫外和氮离子注入方式对其进行诱变选育，与固定化酶进行制备没食子酸及其丙酯的研究。从茶叶中提取分离L-茶氨酸通常涉及耗时、高成本和操作复杂等因素，随着酶工程技术的发展，L-谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰转肽酶、L-谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶几种生物酶的工业合成解决了以上问题［76］。

4 酶在茶叶检测方面的应用

Chindilous［77］通过制作茶叶中酚类物质定量的酶膜传感器，并与光导纤维连用的柱形酶传感器，用于茶叶黄烷醇类的定量检测。崛江秀树等［78］通过在氧电极顶部透氧性聚匹氟乙烯膜表面用丙烯树脂网固定L-氨基酸氧化酶制成的酶传感器，用于测定茶叶中的氨基酸含量。生物酶技术还广泛应用于农药残留检测，主要包括微生物降解技术、酶抑制技术、酶联免疫吸附技术及酶免疫放大技术［79］。许娟等［80］利用硝酸纤维素膜固定植物酯酶，建立了NC 膜固定化植物酯酶快速检测农药残留的方法。李莉梅等［81］采用对乙酰胆碱酯酶抑制率法对市售绿茶中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行了测定的研究。刘淑娟等［82］在金电极表面电沉积二氧化锆纳米粒子以固定乙酰胆碱酯酶（AChE），制成AChE/ZrO2 粒子层/金电极（AChE/ZrO2/Au）电流型有机磷生物传感器，研究了茶叶中的对氧磷有机磷农残的快速检测。傅秀华等［83］试验证实酶解技术还可用于降解茶叶中有机磷农药残留，同时对茶叶品质无明显影响。

5 酶在茶叶其他方面应用

酶在茶叶的贮藏保鲜技术，主要利用酶的专一性和高效性以及安全无污染的特性，快速、彻底地清除茶叶贮藏体系中存在的氧气，阻断茶叶劣变反应，以达到保鲜茶叶的目的。张玲等［84］应用葡萄糖氧化酶与其底物葡萄糖混合在一起，包装于不透水但透气的薄膜袋中，密封后置于装有茶叶的密闭容器内，使茶叶保鲜。黄彤［85］研究了不同种类外源酶对茶汤贮存过程中品质的影响，结果表明添加单宁酶及葡萄糖氧化酶对茶汤的护色及防沉淀效果最好。

孙珂等［86］利用变色栓菌茶渣固态发酵制备的茶渣固态漆酶对双偶氮类染料进行脱色，并研究了脱色机制和脱色效果。黄茂坤等［87］以铁观音茶梗为原料，采用纤维素酶水解法进行改性处理研究，为茶梗综合利用提供了理论依据。

6 酶工程技术在茶叶方面应用的思考与展望

本文综述就今年来国内外各项酶工程技术在茶叶方面的应用，即在茶叶中天然酶的获取，外源酶添加于各类茶叶的初加工过程中以提升原有工艺的茶叶品质；外源酶添加在速溶茶、茶膏、茶饮料的制作过程中以提高饮料的澄清度、提升香气及改善滋味；应用于茶叶天然产物提取，以提高提取率及优化提取工艺；应用于茶叶天然产物合成及制备，以最大程度地保持生物活性等；应用于茶叶检测方面，以实现检测的定量、快速、便捷性；应用于茶叶贮藏保鲜及废料综合利用，为更多应用提供依据。

酶工程技术作为五代现代生物工程技术之一，因酶本身具有反应条件温和、专一性强、反应效率高等特点，在茶叶领域的应用前景广阔。目前在茶叶方面的应用主要有茶叶中各类酶的提取分离，固定化酶技术等在茶叶天然产物的提取与合成，外源酶在各类茶初精制中提升茶叶香气、滋味的应用，外源酶在茶饮料、速溶茶、茶膏改善澄清度、提高提取率、保色等茶叶深加工方面的应用，生物酶传感器等在茶叶检测方面的应用等。但与此同时，酶活性的制约因素也很多，如酶促反应的温度、酸碱条件、辅基、酶蛋白构象、载体性质等，故从茶叶中提取分离酶的成本较高，外源酶活力较难保持等。因此，如何应用最新的酶工程技术，使酶的基础研究转化为应用成果，真正在茶叶大规模生产中使用、实现茶天然产物的工业化生产、快速在线茶叶检测，是值得不断探究的。