脱落酸喷施差异调控橡胶树热研73397和热研917生长和抗逆基因响应机制

樊松乐 王纪坤 安锋 谢贵水 王立丰

(1 农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业农村部儋州热带作物科学观测实验站/中国热带农业科学院橡胶研究所 海南海口 571101;2 海南大学热带作物学院/海南省热带生物资源可持续利用重点实验室 海南海口 570228)

脱落酸（abscisic acid，ABA）是一种加速果实脱落的植物激素，参与调控植物许多生理过程和逆境胁迫反应。巴西橡胶树起源于南美洲的亚马逊河流域，中国属于非传统植胶区，橡胶树种植常会受到干旱［1］、低温［2］等非生物胁迫及白粉病［3］等生物胁迫，制约天然橡胶产业发展。

适当浓度外源ABA的施用可提高橡胶树的抗寒性、导致橡胶树产生逆境胁迫进而影响体内相关基因的表达。王纪坤等［4］研究表明，25 mg/L ABA预处理在4℃低温环境生长的热研73397 芽接苗，在0～144 h 期间，叶片中的超氧化物歧化酶（SOD）活性先降低后增加，过氧化物酶（POD）活性先降低，24 h 后趋于稳定且25 mg/L ABA 处理后抗寒效果最好。王纪坤等［5］研究发现，脱落酸、干旱、吲哚乙酸等处理橡胶树芽接苗后，HbPRX53的表达上调，推测HbPRX53与橡胶树抗逆密切相关。欧阳沫等［6］研究表明100 μmol/L ABA 处理橡胶树热研73397幼茎后，橡胶树HbICE1（冷胁迫信号转导通路的重要转录因子）基因受ABA调控。何海霞等［7］研究表明，200 μmol/L ABA 处理橡胶树芽接苗后，ABA 可诱导Hbmlo7基因显著上调表达。陆燕茜等［8］研究表明，HbMYB62表达量在200 μmol/L ABA 处理橡胶树芽接苗后先显著上调后下调。张宇航等［9］利用ABA 和GA3分别为200 和100 μmol/L 处理橡胶树组培苗，结果表明植物生长调控因子GRF 家族成员HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因受ABA 和GA3调控。橡胶树抗寒剂对橡胶树热研73397 和热研879 等橡胶树品种芽接苗及寒害树割胶面有显著防护和恢复效果［10］。ABA的生物合成及其运输方式、分解代谢、信号转导途径、模式植物相关胁迫诱导基因的表达调控等内容研究较多且比较深入。然而，抗寒剂主要成分ABA对不同抗性品种间橡胶树生长和抗逆性的影响机制尚不清楚。为了分析抗寒剂主要成分ABA对橡胶树不同抗性品种生长和抗逆性调控机制，本研究利用120 μmol/L ABA 处理橡胶树热研73397 和热研917，分析其定位于线粒体和叶绿体相关基因HbCOA、Hb‐COAL、HbCOXI、HbCAX，能量和蛋白合成相关基因HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS，几个关键的抗氧化酶HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD、HbMnSOD基因的表达规律。揭示ABA对橡胶树中抗和高抗性品种生长和抗逆响应基因表达的作用机制。本研究将为阐明橡胶树抗寒剂主要成分ABA对橡胶树生长和抗逆的响应机制提供理论指导及为抗逆技术研发打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

供试的橡胶树品种为热研73397 和热研917 组培苗（株高0.8～1 m），由中国热带农业科学院橡胶研究所儋州基地国家橡胶树种质资源圃提供。

1.1.2 试剂与仪器

多糖多酚植株总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。反转录试剂盒、DL 2000 DNA Marker购自宝生物工程有限公司。ChamQ Univer‐sal SYBR qPCR Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司。主要设备仪器为Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析仪（Gene Company Limited，上海）和伯乐荧光定量PCR 仪（美国）。

1.2 方法

1.2.1 脱落酸处理橡胶树组培苗

用0.05% （V/V） 的乙醇水溶液来溶解配置120 μmol/L 脱落酸（CAS 号：14375-45-2，Merck KGaA，Darmstadt，Germany），处理采用装有120 μmol/L 脱落酸喷壶喷施处理热研73397 和热研917两品种组培苗叶片，对照喷施0.05%（V/V）的乙醇水溶液，分别在处理后0、0.5、2、6、10、24、48 和72 h 采集叶片样品，用液氮速冻后保存到-80℃冰箱。

1.2.2 橡胶树叶片RNA提取和cDNA合成

橡胶树叶片RNA 方法参照TIANGEN RNA 提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，北京，中国］的方法，提取不同采样时间处理和对照组培苗叶片RNA，RNA 浓度与纯度检测使超微量核酸蛋白分析仪用（Thermo Fisher NanoDrop 2000，Gene Company Limited，上海）。cDNA 的合成参考陆燕茜［8］的方法，以反转录得到的cDNA 为模板，扩增内参基因Hb18S，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和内参基因扩增效果。

1.2.3 基因表达分析

HbCOA、HbATP、HbRbsS、HbACAT、HbCOAL、HbCOXI、HbCAX、HbCBP、HbASRLP1、HbAPX、Hb‐CAT、HbCuZnSOD和HbMnSOD荧光定量引物序列（表1）参考wang［11-12］。选用橡胶树Hb18S为内参基因，SYBR Green 法进行定量PCR 检测（伯乐荧光定量PCR 仪），荧光定量PCR（qRT-PCR）反应体系和程序参照肖化兴等［13］方法。

1.2.4 数据统计分析

采用Excel2016 进行数据整理处理，SAS 软件分析差异显著性（单因素ANOVA 检验），Origin‐Pro2018 （Origin Lab Corporation，Massachu‐setts，USA）进行作图。

2 结果与分析

2.1 ABA处理后ROS清除系统关键酶基因表达规律

为了分析ABA处理对橡胶树抗逆性的影响，利用荧光定量PCR 分析橡胶树热研73397 和热研917叶片中ROS 清除系统关键酶基因的表达模式。ABA喷施热研73397 叶片后，HbAPX、HbCAT、HbCuZn‐SOD和HbMnSOD基因在0.5 h时表达量上调，10 h 达到峰值，之后表达量下调。48 h相比较24 h时显著上调，72 h 时基因表达量降到最小值。4 个基因表达量呈现先上调后下调的趋势，表达模式一致。HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbCuZnSOD基因10 h表达量分别是0h 的8.6、10.9、9.3 和3.8 倍（p＜0.01）。ABA 喷施热研917 叶片后，HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbMnSOD基因0～72 h 呈现下调趋势，HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbCuZnSOD基因均在0.5 h 时表达量达到最低，相比较0h 时表达量分别下 调97.6、87.4、42.0 和109.6 倍 左 右（p＜0.01，图1）。

表1 荧光定量引物序列

2.2 ABA 处理后定位于线粒体和叶绿体相关基因HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表达规律

图1 ABA处理后ROS清除系统相关基因HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD和HbMnSOD的表达规律

为了分析ABA 处理对橡胶树热研73397 和热研917 生长的影响，通过qRT-PCR 技术分析定位于线粒体和叶绿体相关基因HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表达模式。ABA 处理后，热研73397 叶片中的HbCOA和HbCOXI在0～72 h 基因表达量均在48 h时达到峰值；HbCOAL和HbCAX在0～72 h基因表达趋势一致，均在10 h 时基因表达量最高。ABA 处理后，热研917 叶片中HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表达模式一致，0～72 h 呈现下调趋势且均在0.5 h 时基因表达量达到最小值，相比较0 h时表达量分别下调69.6、80.7、37.9和80倍（p＜0.01，图2）。

2.3 ABA 处理后能量和蛋白合成HbCBP、HbAS⁃RLP1、HbATP和HbRbsS的表达规律

为了分析ABA 处理对橡胶树热研73397 和热研917 能量消耗和蛋白合成的情况，通过qRT-PCR 技术分析能量合成相关基因HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS的表达模式。ABA 喷施热研73397叶片后，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因在0.5 h 时表达量显著上调，10 h 达到峰值，之后表达量下调，48 h相比较24 h时显著上调，72 h时基因表达量降到最小值，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因10 h 表达量分别是0 h 的8.9、10.8、5.3、9.7倍（p＜0.01），HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因具有一致的表达模式。ABA 喷施热研917 叶片后，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因0～72 h呈现下调趋势，HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS基因均在0.5 h 时表达量达到最低，相比较0 h 时表达量分别下调62.4、56.29、51.3和61.3倍（p＜0.01，图3）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

图2 ABA处理后HbCOA、HbCOAL、HbCOXI和HbCAX的表达规律

图3 ABA处理后能量和蛋白合成相关基因HbCBP、HbASRLP1、HbATP和HbRbsS的表达规律

ABA 信号通路由ABA 特异性受体PYR1（pyn‐bactin resistance 1）、PYR1 类 似 蛋 白（PYLs/RCARs）、下游的磷酸酶（clade-A PP2C）和蛋白激酶（SnRK2） 组成。无ABA 时，ABA 特异 性 受体PYR1/PYLs/RCARs 无法结合到磷酸酶type 2C pro‐tein phosphatases（PP2Cs），PP2C 抑制激酶Sn‐fl-related protein kinase （SnRK2）的活性，抑制下游ABA 响应结合因子的活性；存在ABA 时，ABA 结合ABA 特异性受体PYR1/PYLs/RCARs，PP2Cs的活性被抑制，SnRK2 被磷酸化激活了下游ABA 响应结合因子、具有helix-loop-helix （HLH）结构的转录因子、ABI5 蛋白等［14-15］。植物遭受非生物胁迫比如施用外源ABA以及植物进行光合作用、呼吸作用等均可使植物体内产生活性氧（ROS）。植物体内存在的ROS清除系统包括非酶清除系统和酶清除系统［16］。

本研究利用qRT-PCR 分析120 μmol/L ABA 处理橡胶树热研73397 和热研917 叶片中ROS 清除系统关键酶基因、定位于线粒体和叶绿体相关基因、能量合成相关基因的表达模式，热研73397叶片中HbAPX、HbCAT、HbCuZnSOD、HbMnSOD、HbCBP、HbASRLP、HbATP、HbRbsS、HbCOAL和HbCAX基因在0.5 h 时表达量显著上调。热研917 叶片中上述基因在0～72 h 呈现下调趋势，0.5 h 下调到最低值。说明二者对ABA 具有差异响应机制。HbCOA是一种长链-脂肪-酰基-辅酶a 还原酶基因（EC 1.2.1.50），在天然橡胶生物合成和ABA 合成中起重要作用［17］。抗坏血酸过氧化物酶基因HbAPX参与了抗氧化系统的研究［18］。在橡胶树中，Hb‐CuZnSOD和HbMnSOD编码了抗氧化超氧化物歧化酶，并证实了它们在干旱响应中的作用［19］。HbRbsS编码一种参与碳固定的酶。HbATP编码巴西橡胶树线粒体ATP 合酶b 亚基，为植物体生理生化过程提供能量。HbCBP编码一种柠檬酸结合蛋白质［20］。HbASRLP1是一种脱落酸应激蛋白。植物体内ROS清除，光合作用，膜通透性和其他细胞过程的酶活性以及代谢反应均与橡胶树耐寒性相关［21-22］。Du等［23］研究表明，施外源ABA 使得土壤ABA 浓度达到10 μM 后，干旱胁迫下的春小麦品种（Triti‐cum aestivumL.、现代品种陇春8275）的抗氧化酶（SOD、CAT、APX 和GR）活性和叶片中ABA 含量均有提高，ROS 和脂膜过氧化物水平降低，籽粒蒸腾效率增加。后有丽等［24］研究表明6 mg/L 的外源ABA 处理红砂叶片后，随着处理天数的增加叶片中SOD、POD、CAT 活性总体均呈现先上升后下降的趋势，与处理之前相比分别上升28.94%、35%、84.46%。ABA 缓解了由干旱胁迫引起的损害。Wang等［11］研究表明，干旱处理橡胶树GT1实生苗，ROS清除系统和定位于线粒体和叶绿体相关基因CuZnSOD、HbMnSOD、HbAPX、HbCAT、HbCOA、HbATP和HbACAT的先显著上调并在断水3 d 时达到最大值，随后断水5 d 后下调。本研究在橡胶树热研73397叶片中的抗氧化酶基因的表达模式与wang等的研究一致，后有丽等测定的抗氧化酶活性变化趋势也和本研究抗氧化酶基因的表达模式一致。光合作用是植物生长发育的基础且低温和光照强度对其影响较大，呼吸作用主要通过线粒体，而且线粒体和叶绿体在ABA生物合成和信号转导发挥了重要作用，二者均可为植物体提供能量并且和植物的生长相关。

脱落酸在胁迫下调控光合作用中起重要作用。田礼新等［25］研究表明适当浓度的ABA 可提高玉米幼苗叶片的光合能量，提高PSⅡ反应中心活性进而增强耐冷性。陈靠山等［26］利用ABA 处理后提取玉米和大豆的线粒体，结果表明，ABA 增加线粒体的耗氧速率和呼吸作用。Travaglia 等［27］研究表明，外源ABA能提高田间小麦叶绿素、胡萝卜素含量和小麦的产量。Teng 等［28］研究表明，在PEG 胁迫下，外源ABA的施用显著提高了旱稻（UR）的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率，增加了Os‐PsbD1、OsPsbD2、OsNCED2、OsNCED3、OsNCED4、OsNCED5的表达，在UR 遗传背景中，叶绿体和ABA生物合成相关基因在外源ABA 诱导的光系统II（PSII）中发挥作用。植物体能量合成相关基因和ROS 清除系统关键酶基因的表达模式相似。本研究结果表明，中抗品种热研73397叶片中的能量合成相关基因和ROS 清除系统关键酶基因受ABA 调控，在0～72 h 呈现先上调后下调的趋势。HbATP基因表达趋势和其他基因相似，在10 h 时基因表达量达到峰值，约是0 h 的5.4 倍。高抗品种橡胶树热研917 叶片中的能量合成相关基因和ROS 清除系统关键酶基因下调表达。

在植物中发现了2 种类型的冷驯化途径：ABA依赖性途径和ABA 非依赖性途径［29］。ABA 依赖性途径需要ABA 的积累和激活ABF、MYB、MYC 等转录因子，转录因子与ABRE、MYBRS 和MYVRS 顺式作用元件结合激活RD22 和RD29B 等功能基因增强抗寒性；ABA 非依赖性途径不需要ABA 激活基因，如ICEICBF 途径，冷胁迫下ICE1 被激活进而诱导CBF 转录因子表达，CBF 与CRT/DRE 元件结合调控COR 基因的表达增强抗寒性［30-32］。Cheng 等［32］使用North‐ern 印迹分析了针对冷胁迫和ABA 处理的基因表达谱，研究表明橡胶树HbCBF1响应冷胁迫，而对干旱或ABA胁迫无响应；利用遗传转化技术获得Hb‐CBF1过表达拟南芥植株，研究发现HbCBF1过表达激活COR15a和RD29a基因的表达。

胁迫诱导ROS产生导致多不饱和脂质降解，形成丙二醛（MDA）。Yuan 等［31］研究表明35S：HbI‐CE1拟南芥植株抗寒性的提高是脯氨酸积累增加，电解质泄漏和MDA 代谢减少以及寒冷条件下H2O2积累减少的结果。王纪坤等［4］研究发现，50 mg/L ABA 处理在4℃人工气候室生长的热研73397 芽接苗，MDA 含量在0～144 h 呈现先下降后上升在降的趋势，144 h 时，橡胶树芽接苗叶片中的MDA 含量最低。Cheng等［30］在橡胶树中鉴定参与ABA合成和降解过程的限速酶9–顺式–环氧类胡萝卜素加双氧酶基因（NCED）、4 个细胞色素P450CYP70A基因，转录组分析表明在CATAS93-114 中，NCED和ABA2表达量较高，CYP707A1表达量较低，与Rek‐en501 低温敏感品种相比，CATAS93-114 抗性品种在低温条件下积累了更多的ABA。表明橡胶树ABA依赖的信号途径方面，低温诱导橡胶树内源ABA积累，然而在不同抗性橡胶树品种中表现出差异：抗性品种ABA 合成关键酶基因ABA2表达高，降解酶CYP707A1基因表达表达较低；而在低温敏感品种中则相反。因而在抗寒橡胶树品种中，内源ABA含量较高。ABA 不依赖信号途径基因表达，在不同抗性橡胶树品种间未表现出表达差异。因此，ABA信号途径决定了橡胶树抗寒能力的差异。据此笔者推测，ABA 处理后橡胶树热研73397 组培苗后产生了胁迫导致体内ROS平衡破坏进而激活植物体内ABA 依赖性途径的防御机制，启动ROS 清除系统和调动体内能量合成相关基因抵抗胁迫。与之相反，120 μmol/L ABA 处理后橡胶树热研917 组培苗后并未使其产生胁迫，植物体内不需要调动能量合成相关基因和ROS 清除系统关键酶基因表达。热研917 品种比热研73397 抗逆能力强。因此，在橡胶树栽培技术研发中，应针对不同抗性品种特性调整增产素和抗寒剂成分组成。

3.2 结论

120 μmol/L ABA 处理中抗品种热研73397 和高抗品种热研917组培苗叶片后，定位于线粒体和叶绿体相关基因、能量和蛋白合成相关基因和ROS清除系统关键酶基因受ABA 差异调控。热研73397 品种显著上调表达，热研917叶片中的能量合成相关基因和ROS清除系统关键酶基因整体下调表达。应针对不同抗性品种特性调整增产素和抗寒剂成分组成。