植物病原卵菌效应蛋白RXLR和CRN研究进展

郭泽西 曲俊杰 刘露露 尹玲

(广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 广西南宁 530007)

从传统的生物分类学来看，卵菌被认为是一种真菌。但从遗传和系统发育学角度来看，卵菌在各个方面的表现更接近于藻类生物，如褐藻和硅藻等。尽管卵菌被界定为真菌类生物，但卵菌与真菌之间却存在如下几点的不同：（1）二者细胞壁成分不同，真菌多由几丁质构成，而卵菌主要由纤维素构成；（2）卵菌菌丝基本上不会发生分隔，多是无隔菌丝体；（3）卵菌的营养体是二倍体，而真菌却是单倍体；（4）卵菌不同于普通真菌的另一点是其游动孢子往往带有双鞭毛［1］。

近年来，研究比较多的植物卵菌主要包括疫霉属（Phytophthora）、霜霉属（Peronospora）、腐霉属（Pythium）、假霜霉属（Pseudoperonos‐pora）和白锈菌属（Albugo）。目前已经完成大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、马铃薯疫霉菌（Phytophthora infestans）、黄瓜霜霉菌（Pseu‐doperonospora cubensis）、拟南芥霜霉菌（Hya‐loperonospora arabidopsidis）、终极腐霉（Py‐thium ultimum）、十字花科白锈菌（Albugo can‐dida）、葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）等病原卵菌的全基因组测序［2-9］，这标志着对植物病原卵菌的研究逐渐深入到基因组层面。此外，根据现有的植物病原卵菌的基因组数据，利用生物信息学的数据分析手段，能够更全面地阐释不同类型的病原卵菌的致病机理，对理解病原卵菌的致病机制以及进化历程都有积极影响。针对病原卵菌的致病机理研究主要在效应蛋白上。效应蛋白是指病原卵菌在侵入植物组织后分泌出的一种能够影响植物体生长、发育等过程的小分子蛋白质［10］。本文对卵菌效应蛋白的挖掘方法、转运机制和靶标蛋白筛选等研究热点进行总结和概述。

1 卵菌效应蛋白的分类和挖掘

根据效应蛋白的靶标位置，将其分成胞外蛋白和胞内蛋白两类。胞外蛋白，即指卵菌分泌的效应蛋白作用于植物细胞外，通过与植物细胞间的信号蛋白或植物细胞膜上的受体结合而发挥作用，也被叫做激发子。目前研究较多的激发子有：细胞坏死诱导蛋白（NLPs） 和各种蛋白酶抑制子［11］。胞内蛋白指分泌到被侵袭植物细胞内的蛋白，这类蛋白目前研究较多的有RXLR和CRN蛋白。

效应蛋白的传统挖掘方法为图位克隆。近年来，基因组测序和转录组测序技术的成熟，为快速高效挖掘效应蛋白提供了有利工具。当科学家完成了大豆霉菌的基因组测序后，发现大豆霉菌的效应蛋白致病机制非常复杂，在侵袭植物细胞的过程中往往同时涉及多达数百个功能蛋白［2］。

通过对图位克隆方法得到的Avr3a、Avr1b 等多个效应蛋白的序列分析发现，这两类效应蛋白的氨基末端的顺序是稳定的［12-16］。这一研究结果证明，运用生物信息学分析方法来研究效应蛋白的科学性和合理性。研究表明，RXLR 效应蛋白的氨基端通常有RXLR-dEER 模块序列，在羧基端则连接有不同的结构域。CRN 效应蛋白的氨基酸序列则与之不同，该类效应蛋白的氨基端往往连接有LXLFLAK 序列元件和DWL 结构域，在羧基端同样包括多种多样的结构域。基因组测序分析显示，大豆疫霉约含有396 个RXLR 效应蛋白，拟南芥霜霉菌有134 个，橡树疫霉菌有374 个，马铃薯疫霉菌有563 个，葡萄霜霉菌有100 个［17］。由此可见，RXLR 效应蛋白在卵菌中分布非常广泛［2，4-5］。Tian等［18］的研究结果表明，黄瓜霜霉菌中除了RXLR效应蛋白外，还存在较多的QXLR 效应蛋白，推测QXLR 和RXLR 两类效应蛋白可能具有相似的生物功能。CRN 效应蛋白在多样性和数量上都远远低于RXLR效应蛋白。

2 RXLR转运机制的研究

Guo 等［19］发现，革兰氏阴性病原菌把自身产生的效应蛋白分泌到寄主细胞内，主要依靠其自身的Ⅲ型分泌系统，该过程对于研究病原菌的致病机理非常重要。鉴于该机理，研究人员逐渐找到了研究效应蛋白致病机理的切入点，即效应蛋白从卵菌中分泌后是如何转运到宿主细胞的。初步研究显示，卵菌分泌出效应蛋白后，这些效应蛋白必须要以某种方式穿过宿主细胞的细胞膜进入细胞内才能发挥相应的作用。该功能的实现往往取决于效应蛋白上的一段特殊转运结构域序列，如RXLR［15，18］、LXLFLAK［11，19］和CHXC［20］。

RXLR 效应蛋白穿过细胞膜的机理研究比较多。RXLR 效应蛋白通常是由卵菌的吸器所分泌产生，其氨基端和疟原虫效应蛋白有很多相似之处。Marti 等［21］研究发现，疟原虫的效应蛋白穿越宿主细胞（红细胞）的细胞膜主要依赖于其氨基端的Pexel基序，推测卵菌的效应蛋白穿过细胞膜也依赖RXLR-EER 片段。Whisson 等［22］通过实验对此推论进行了验证。实验将致病疫霉菌的无毒蛋白Avr3a的氨基端特定序列和GusA基因进行融合，表达于特定的疫霉菌，并用该菌株对马铃薯进行侵染。结果发现，仅有菌丝周围的叶片细胞表现出GUS活性。如果将该蛋白的氨基端RXLR-EER基序突变为RXLR-AAA、AAAA-AAA 或KMIK-DDK，侵染马铃薯后无法表现GUS 活性。Kale 等［23］对该结果进行了反复的实验论证，结果表明，RXLR 效应蛋白结构上的结构域通过与植物宿主细胞膜上的PI3P 结合，调节相应的信号通路，使效应蛋白被宿主以内吞的方式进入宿主。然而，该机理并未得到业内的广泛认可。Gan 等［24］经过实验证明，亚麻锈菌的分泌的AvrM 和AvrL567 进入宿主细胞并不需要PIP3 的 参 与。Yaeno 等［25以AVR3a、AVR3a4 和AVR1b 三种常见的效应蛋白为研究对象，通过实验无法重现RXLR 的氨基端序列与PI3P 结合。他们通过该实验却意外发现同PI3P 结合进而转运至细胞内并非RXLR的氨基端，而是羧基端。他们还发现，AVR3a蛋白通过这种与宿主细胞膜上的PI3P结合而进入宿主细胞的过程能够提高蛋白的稳定性。鉴于Bailey K 等［16，18］的研究结果，他们最终否认了AVR3a羧基端与效应蛋白转运机理有关。

从上述研究结果可知，RXLR 效应蛋白转运至宿主细胞的机理目前仍然不清楚，可能是通过多种途径转运进入。Stephan Wawra等［26］发现，寄生水霉菌分泌的SpHtp1 是通过与膜上的磺基酪氨酸结合来侵入寄主的。长期以来，人们认为疟原虫的效应蛋白的PEXEL/HT 基序在其内质网内被特异切割，在分泌前使其氨基端的序列被乙酰化，从而以特殊的机制顺利进入宿主细胞［27-28］。Bhat‐tacharjee 等［29］的研究表明，在宿主细胞的内质网上，PEXEL基序会同PI3P结合并被识别。这些研究充分表明RXLR 效应蛋白进入宿主细胞机理的复杂性和多样性，也为进一步阐释效应蛋白的转运机理及作用机理提供参考。

3 靶标蛋白的筛选

3.1 RXLR效应蛋白的靶标

明确卵菌效应蛋白在寄主体内的靶标蛋白，对于理解效应蛋白的致病机理和参与植物免疫的蛋白组分都是非常重要的。

已经证实效应蛋白侵染植物进而干扰其免疫反应的类型是各种各样的。大豆疫霉菌效应因子PSR1 和寄主体内一个RNA 解旋酶（RNA helicase）PINP1 蛋白相互作用，使小RNA 在植物体内的积累被抑制，植物自身的防御过程被扰乱，从而促进卵菌在宿主细胞内繁殖，使植物体染病［30］。PsAvr3c 能够与大豆细胞核前体RNA 剪接体蛋白GmSKPP 互作，进而负调控先天免疫［31］。PsAvh240与位于质膜上天冬氨酸蛋白酶GmAP1相互作用，进而抑制GmAP1的表达，从而抑制植物质外体免疫反应［32］。在马铃薯晚疫病菌中，PiAvrblb1和一个植物凝集素受体激酶LecRK-1.9 互作从而破坏植物细胞壁和质膜的稳定性帮助病原菌增殖［33］。PiAvr‐blb2在病原菌细胞膜表面和寄主蛋白酶C14互作并阻止其分泌［34］。Pi03192通过与可能参与免疫反应的转录因子NTP1 和NTP2 的互作来阻止其向细胞核的转移来干扰免疫反应［35］。PiAvr3a效应蛋白和寄主细胞内的一个E3 泛素连接酶CMPG1 相互作用，并增加CMPG1 的稳定性，同时这种识别能够被R 蛋白R3a 间接识别，并激活寄主的ETI 反应，产生HR和细胞坏死［36］。PiAVR2 和蛋白磷酸酶BSL1、BSL2以及BSL3 互作，负调控BSL1 和BSL3 抑制INF1 诱导的细胞死亡［37］。PexRD2 和MAPKKJKs 激酶结构域相互作用后，抑制细胞间的MAPK 的传导途径［38］。辣椒疫霉的RxLR207 会促进拟南芥中ACD11 的结合配体BPA1、BPL1、BPL2、BPL4 降解，通过调控活性氧（ROS）的浓度发挥免疫作用［39］。在拟南芥霜霉菌中，效应蛋白HaRXL44能够和拟南芥体内一个调节亚基MED19a 互作，并抑制和水杨酸有关的基因表达［40］。HaRXL106 抑制水杨酸（SA）诱导的防御基因的转录激活，并改变植物对光的生长反应［41］。葡萄霜霉菌分泌的效应蛋白PvRXLR54 与葡萄叶绿素蛋白VvCBP151 直接互作，通过影响该叶绿素蛋白的光能吸收与转化来抑制其先天免疫［42］。葡萄霜霉菌效应蛋白PvRxL13 与葡萄的转录因子HY5互作从而抑制其转录活性［43］。葡萄霜霉菌效应蛋白PvRxLR16 通过其W/Y/L 结构域与3 个预测糖基化位点来识别到葡萄中靶标蛋白为VaCUE［44］。

3.2 CRN效应蛋白的靶标

目前只有很少量的CRN 效应蛋白的靶标被发现。大豆疫霉菌分泌的PsCRN63 和PsCRN115 共同作用于宿主细胞的CAT1，使得宿主细胞内的PCD和过氧化氢维持在一个相对平衡的状态，从而干扰宿主细胞的免疫过程［45］。宋天巧等［46］发现，PsCRN108 能够调控宿主细胞的转录过程，该效应蛋白通过与宿主细胞的基因HSP90上的启动子位点特异结合，使宿主体内无法正常表达防御蛋白，从而使宿主“顺利”染病，这说明CRN效应蛋白能够对植物细胞内的正常功能进行干扰。

4 展望

植物病原卵菌效应蛋白的致病机制一直是研究的重点和热点。植物与病原卵菌在长期的侵染与免疫中，共同进化。病原卵菌分泌出的效应蛋白破坏寄主的免疫反应，寄主分泌相应的抗病蛋白来识别效应蛋白。目前，全基因组和转录组测序技术和生物信息学分析等技术的应用使得更多病原卵菌的效应蛋白被挖掘。这有利于阐明不同病原菌之间的致病性差异，为探索病原菌的致病机制和进化过程提供丰富的资源。然而，和真菌以及细菌相比，对卵菌的效应蛋白的靶标蛋白的了解比较少。病原卵菌的效应蛋白数量众多，多数的效应蛋白与寄主之间的互作方式和效应蛋白之间的互作以及进入寄主细胞的转运机制都尚未清楚。因此，还需做大量的研究来解析效应蛋白的致病机理和侵染过程等，为植物—病原物互作的分子机制研究提供理论依据和参考。