细胞遗传学异常对硼替佐米疗效的影响

蔡宜诺，刘景华，周 凡，王吉刚，田 华，刘丽欣，张 帆，刘彦琴，佟丹江，孟广晗，张美玉

0 引言

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)由于其高度的异质性，患者生存时间存在较大差异，而导致其异质性的重要因素之一为细胞遗传学的异常。根据细胞遗传学异常所发生的时间及在MM起病及疾病进展中的作用，分为原发异常及继发异常。超二倍体和非超二倍体的改变均属于原发异常，如常见的免疫球蛋白重链IgH的重排，而13号染色体缺失、17p13缺失、1p缺失、1q扩增及c-myc易位为常见的继发异常[1]。细胞遗传学的异常严重影响了患者的预后，因此，在ISS分期的基础上，根据乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)及高危细胞遗传学[17p-、t(4;14)、t(14;16)]，进一步将MM进行ISS-R危险分层[2]。为研究新诊断的多发性骨髓症(NDMM)患者对硼替佐米治疗的反应是否受细胞遗传学异常的影响，本文回顾性分析2017年1月至2020年6月的110例接受以硼替佐米为基础治疗的NDMM患者的疗效与细胞遗传学细胞的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源 对110例NDMM患者进行骨髓穿刺，均留取3 ml骨髓液，其中85例进行FISH检测，8例患者因放弃治疗、失访等原因无法进行疗效评估，最后选取77例可评估疗效的病例进行分析。

1.1.2 主要实验试剂 MACSprep MM CD138 MicroBeads (# 130-111-744)-CD138骨髓分选磁珠；Whole Blood Column Kit (# 130-093-545)-全血分选柱套装；MACS BSA Stock Solution (# 130-091-376)；autoMACS®Rinsing Solution (# 130-091-222)；autoMACSTMRunning Buffer (# 130-091-221)；1∶20稀释用于配制separation buffer或separation buffer；MACS®SmartStrainers,100 μm (# 130-098-463)。滤器：过滤骨碎片/骨髓脂肪颗粒/细胞团。探针：雅培，CYCTOCELL。卡诺氏固定液：乙酸和甲醇，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CD38磁珠分选浆细胞 ①从抗凝管中取3 ml骨髓；②骨髓样本处理：通过MACS®智能过滤器(100 μm)传递细胞，以去除骨碎片或细胞团块；③在445×g下离心10 min，取出弃上清；④每1 ml抗凝骨髓或全血加入50 μl MACSprep多发骨髓瘤CD138微珠；⑤混匀，室温下孵育15 min(19～25 ℃)；⑥进行磁选：将全血柱放置在合适的MACS分离器的磁场中，用3 ml分离缓冲液冲洗准备柱，将磁性标记的细胞悬液滴在制备的全血柱上，收集被标记的细胞，未标记细胞的流过；⑦用2×2 ml分离缓冲液冲洗全血柱；⑧从分离器中取出全血柱，放置在新的收集管上；⑨将4 ml全血柱稀释缓冲液输送到全血柱上，立即冲洗磁性标记的细胞，推动柱塞进入柱收集细胞；⑩将富集之后的细胞用卡诺氏固定液进行2次固定，制成细胞悬液，滴片，56 ℃老化2 h，进行清洗，探针杂交。

1.2.2 浆细胞FISH检测 ①将新鲜骨髓液标本进行前期处理，取2 ml骨髓液，离心弃上清，经过浓度为0.075 mol/L低渗液进行低渗处理，再用卡诺氏固定液对低渗过后的悬液进行3次固定处理，制成细胞悬液。调制成适宜的细胞浓度进行滴片。②将滴好的玻片放入56 ℃的烤箱进行老化处理，时间为30 min～1 h。③将玻片从烤箱取出恢复至室温后，浸入50 ml 2×SSC中各洗涤3 min，梯度脱水70%酒精、80%酒精、100%酒精各3 min，晾干(≤6个载玻片/缸)。④加相应检测项目的探针标准用量在玻片上，先将探针试剂混匀后加于玻片杂交区域内，盖上盖玻片，胶(美国Vysis公司产品)封片后置于37 ℃原位杂交仪中杂交过夜。杂交后标本在(72±1) ℃，0.4×SSC/0.3%NP-40的洗液中洗涤5 min，待其温度降下，将玻片浸入50 ml 2×SSC中，两缸各1 min，梯度脱水70%酒精、80%酒精、100%酒精各1 min，晾干(≤6个载玻片/缸)。避光晾干后加二咪基苯基吲哚(DAPII)/抗淬灭剂(Vysis公司产品)复染。用蔡司(Iamger.A2)荧光显微镜，在荧光通道下观察间期细胞的荧光杂交信号，至少分析200个细胞，不计数重叠细胞。

1.2.3 FISH结果的判读 分析200个细胞。1q21(CKS1B)基因扩增：红色荧光标记CKS1B(1q21)探针，正常信号模式为2R(注：R为红色信号)，阳性结果判断阈值6.87%。t(4;14)易位形成的IGH/FGFR3融合基因：绿色荧光标记IGH(14q32)探针，红色荧光标记FGFR3(4p16)探针，IGH/FGFR3融合基因显示黄色或绿色与红色叠加信号，正常信号模式为2G2R(注：G为绿色信号，R为红色信号)，阳性结果判断阈值6.47%。t(14;16)易位形成的IGH/MAF融合基因：绿色荧光标记IGH(14q32)探针，红色荧光标记MAF(16q23)探针，IGH/MAF融合基因显示黄色或绿色与红色叠加信号，正常信号模式为2G2R(注：G为绿色信号，R为红色信号)，阳性结果判断阈值3.37%。t(14;20)易位形成的IGH/MAFB融合基因：绿色荧光标记IGH(14q32)探针，红色荧光标记MAFB(20q12)探针，IGH/MAF融合基因显示黄色或绿色与红色叠加信号，正常信号模式为2G2R(注：G为绿色信号，R为红色信号)，阳性结果判断阈值1.32%。17p13.1(p53)基因缺失：红色荧光标记p53(17p13.1)探针，正常信号模式为2R(注：R为红色信号)，阳性结果判断阈值6.09%(见图1)。

图1 FISH各探针正常图像

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。组间计数资料之间比较应用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH检测结果 110例以硼替佐米为基础诱导化疗的NDMM中，77例骨髓细胞进行了CD38磁珠分选后1q21、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)、17p-的FISH检测。77例患者中阴性29例，1项异常34例，2项异常13例，3项异常1例。1q21阳性39例，其中7例合并t(4;14)阳性，4例合并17p-阳性，2例合并t(14;16)阳性，1例合并t(4;14)和17p-阳性，单纯1q21阳性25例；1q21阴性38例，其中4例t(4;14)阳性，5例17p-阳性，单纯1q21阴性29例；t(4;14)阳性12例，t(4;14)阴性65例；t(14;16)阳性2例，t(14;16)阴性75例；17p-阳性10例，17p-阴性67例；77例均t(14;20)阴性。见表1。

表1 FISH检测结果[例(%)]

2.2 FISH异常各亚组以硼替佐米为基础诱导化疗的疗效 FISH检测阴性组共29例(38%),其中(0 FISH组)CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.9%；FISH检测1项异常组(1 FISH组)共34例(44%)，其中CR 5例，VGPR 19例，PR 7例，MR 1例，SD 1例，PD 1例，ORR 91.2%；FISH检测2项及以上异常组(2FISH组)共14例(18%)，其中CR 4例，VGPR 7例，PR 1例，MR 1例，SD 1例，ORR 85.7%。三组ORR两两对比，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 FISH异常各亚组的疗效

2.3 各不良预后FISH异常组以硼替佐米为基础诱导化疗的疗效 25例单纯1q21阳性的患者中，CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 1例，PD 1例，ORR 88%；29例单纯1q21阴性的患者中，CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.8%。两组ORR比较，差异无统计学意义(P=0.25)。见图3。

图3 1q21阳性与1q21阴性组的疗效的比较

12例t(4;14)阳性的患者中，8例合并1q21扩增，其中1例合并17p-。12例患者中CR 4例，VGPR 8例，ORR 100%，但2例患者分别在3个月、6个月疾病进展，且1例患者发生髓外浸润(死亡)；65例t(4;14)阴性的患者中，31例1q21扩增，其中4例合并17p-，2例合并t(14;16)，另34例患者中17p- 5例；29例单纯t(4;14)阴性的患者中，CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.8%。t(4;14)阳性与阴性组的ORR比较差异无统计学意义(P=0.062)。见图4。

图4 t(4;14)阳性与t(4;14)阴性组疗效比较

10例17p-阳性的患者中，5例合并1q21扩增，其中1例合并t(4;14)，10例患者中CR 1例，VGPR 6例，PR 1例，MR 1例，SD 1例，ORR 80%，但1例患者在16个月疾病进展；67例17p-阴性的患者中，34例1q21扩增，其中7例合并t(4;14)，2例合并t(14;16)，另33例患者，4例t(4;14)，29例单纯17p-阴性(CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.8%)，两组ORR比较差异无统计学意义(P=0.58)。见图5。

图5 17p-阳性与17p-阴性组的疗效的比较

本组77例行FISH检测的患者中仅有2例t(14;16)，因阳性患者较少，阳性组与阴性组之间疗效未能进行比较。

3 讨论

多发性骨髓瘤作为一种高度异质性的克隆性浆细胞肿瘤，其总体生存期2～10年。高异质性除与白蛋白、β2微球蛋白、乳酸脱氢酶相关外，更重要的是细胞遗传学的异常。由于骨髓瘤细胞的低增殖特性，传统的细胞遗传学检测漏掉了很多细胞遗传学异常，因此，间期FISH(iFISH)是首选方法，可检测大于60%的遗传变化[2]。本组77例NDMM做了高危细胞遗传学[17p-、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)]及1q21的检测，结果阳性率为62.3%，高危细胞遗传学异常的阳性率为29.9%，与文献报道的阳性率大致相符[2-3]。

MM患者的总体生存期很大程度上取决于肿瘤细胞的细胞遗传学改变，因此，2015年开始在ISS分期的基础上增加高危细胞遗传学参数，即目前我们广泛采用的ISS-R临床分期[4]。从MM长远的生存期看，尤其是17p-患者，目前尚无药物克服这一遗传学的改变，使得这一高危遗传学改变的患者总体生存期明显缩短。在本研究的77例患者中，0 FISH组、1 FISH组、2 FISH组的阳性率分别为38%、44%、18%。0 FISH组与Grzasko等[5]报道的37.3%相似，1 FISH组大于其报道的29.8%，2 FISH组小于报道的32.9%。本研究中，3组CR率分别为17.2%、14.7%、28.7%，CR+VGPR率分别为55.1%、70.6%、78.7%，结果表明，FISH检测异常数目增加，但缓解率并没有下降(不除外各组患者应用除硼替佐米之外的其他药物所致的高缓解率)。

近年对于17p-、t(4;14)数据研究较多，而t(14;16)在骨髓瘤中发生率较低,约3%～5%[6-7]。Avet-Loiseau等[6]回顾性分析1 003例新诊断的多发性骨髓瘤患者t(14;16)，发现染色体易位发生率较低，仅为3.2%(32例)。进一步按照细胞遗传学的改变，我们对1q21、t(4:14)及17p-进行了缓解率的比较。

IMWG 1q21扩增尚不属于高危细胞遗传学[8]，大多数研究证明其具有不良预后意义，其存在与较短的PFS和OS有关[9]。1q21的扩增对预后的影响主要与扩增的拷贝数相关，扩增拷贝数>3对生存的负影响已成为定论[10]。本组77例患者中1q21阳性39例，但15例患者合并了其他高危的细胞遗传学改变，38例1q21阴性的患者中，9例合并了其他高危的细胞遗传学改变，为避免其他细胞遗传学的影响，我们对单纯1q21阳性和阴性患者的缓解率进行了比较，两组CR率分别为20%、17.2%，CR+VGPR分别为64%、55.1%，可见1q21的扩增并没有影响以硼替佐米为基础诱导化疗的疗效。同样Chen等[11]研究中，1q21阳性硼替佐米组与非硼替佐米CR率分别为52.94%、10%(P=0.019)，可见硼替佐米可改善1q21阳性缓解率的负面影响。

由于硼替佐米的一线应用，t(4;14)异常这一高危细胞遗传学改变已逐渐被向中危划分[12]。本研究中，77例患者的t(4;14)阳性率为15.9%，CR率33.3%，VGPR率66.7%，与Grzasko等[5]报道的t(4;14)阳性率为16.3%相似。29例单纯t(4;14)阴性的患者中，CR率17.2%，VGPR率37.9%，与 Mateos等[13]结论相似(VMP/VTP诱导化疗后包括17p-在内的高危组CR率24%，标危组25%),表明t(4;14)不影响硼替佐米的缓解率。

尽管MM新的治疗药物不断涌现[14]，目前仍没有药物能够克服17p-的不良预后，17p-仍然是MM最高危的细胞遗传学改变，短期内硼替佐米诱导可改善t(4;14)患者的预后，但不能改善del(17p)患者的预后[12]。本研究中的77例NDMM患者，17p-的阳性率12.9%，CR率10%，VGPR率60%，ORR 80%。与Cohen等[15]回顾性研究中，应用硼替佐米诱导治疗17p-总缓解率为85%一致。17p-阴性29例患者中，CR率17.2%，VGPR率37.9%，与Liu等[16]报道一致，17p-阳性和阴性患者短期缓解率差异不显著，表明17p-阳性不影响硼替佐米的缓解率。

4 结论

NDMM细胞遗传学改变很大程度上影响患者的总生存期，但从短期疗效看，即使存在高危细胞遗传学改变，也不影响硼替佐米的缓解率。因此，硼替佐米仍然是NDMM患者的首选用药。