玫瑰树碱对骨关节炎及滑膜组织SIRT1-Nrf2信号活化的作用研究

宋 超，谢 育，王 冶，蒲劲松，陈 林，郭浩然，崔瀚文

0 引言

骨关节炎是一种多因素疾病，具有较高的致残率，尚无有效的治疗方法[1]。骨关节炎病理机制复杂，主要有炎性细胞因子的分泌、关节软骨的机械性损伤以及软骨细胞的凋亡，这些因素均能够引起氧化应激反应[2]。核因子NF-E2相关因子(Nrf2)作为机体的关键氧化还原敏感性转录因子，对改善机体氧化应激状态、促进细胞存活以及维持细胞的氧化还原稳态具有关键意义。沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)是一种高度保守的NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶类，具有调节有丝分裂、炎症反应、氧化应激和抗凋亡等多种效应。有报道，Nrf2和SIRT1参与骨关节炎的病理发展，两者激活是骨关节炎治疗的潜在信号通路。

玫瑰树碱提取于夹竹桃科植物，是一种生物碱，具有抗肿瘤和抗HIV活性[3]。玫瑰树碱对神经母细胞瘤和膀胱癌在内的多种肿瘤均有活性，并且与细胞周期和凋亡信号有关[4-5]。另外，研究发现，玫瑰树碱也具有抗炎活性，可以减弱脂多糖诱导的巨噬细胞活化和败血性休克[6-7]。但玫瑰树碱的抗骨关节炎活性研究较少，故本研究探讨玫瑰树碱对骨关节炎的治疗作用及对Nrf2和SIRT1信号活化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Nrf2、HO-1、SIRT1、p-AMPK和AMPK及β-actin抗体(Abcam，英国)；IL-6、IL-1β、TNF-α大鼠ELISA试剂盒(联科，中国)；电子自动爪触觉测试仪(瑞沃德，中国)；双氯芬酸钠肠溶片(北京诺华制药有限公司，国药准字H11021640)；玫瑰树碱(上海陶术生物科技有限公司，中国)。

1.2 动物分组与给药 根据文献报道[8-9]，60只SPF级别雄性SD大鼠(220～250 g)随机分为假手术组、模型组、玫瑰树碱低剂量组(5 mg/kg)、中剂量组(10 mg/kg)、高剂量组(20 mg/kg)和阳性对照组(双氯芬酸钠肠溶片，4 mg/kg)，每组10只。术后2周灌胃给予玫瑰树碱，模型组和假手术组大鼠给予等体积的生理盐水，每天1次，连续给药3周。

1.3 骨关节炎大鼠模型建立 有报道，大鼠隔夜禁食12 h，使用右膝关节前交叉韧带切断术建立骨关节炎大鼠模型。腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，固定于操作台，将右膝关节刮毛备皮后，用碘伏消毒，在无菌条件下于膝关节内侧切约1 cm纵向切口，然后用镊子将韧带拉到一侧，切开内侧副韧带以打开关节腔，同时小心切断前交叉韧带、内侧副韧带和内侧半月板，缝合膝盖皮肤和关节囊，术后连续肌肉注射4 d氨苄青霉素(4×104U/d)，假手术组大鼠切开并缝合膝盖的皮肤和关节囊。

1.4 骨关节炎大鼠机械性异常疼痛 用电子自动爪触觉测试仪测量大鼠PWT值，每周1次。简要操作如下：将刺激针对准大鼠的足底，随后逐渐增加刺激力量，待大鼠感到疼痛后，移开刺激针，设备将记录并显示刺激针瞬间移开的最大值，即PWT，测量时每5分钟1次，连续3次，计算平均值。机械性异常性疼痛通过测量撤回阈值来校准的von Frey细丝进行评估。

1.5 骨关节炎大鼠关节炎评分 根据以下标准对大鼠的关节炎进行评分(0～4分)：无关节炎计0分；关节轻度发红肿胀计1分；关节中度发红肿胀计2分；关节严重发红肿胀计3分；关节严重发炎，并且负重困难计4分。

1.6 酶联免疫吸附法(ELISA)测量炎症因子含量 待给药结束后，大鼠腹主动脉取血，随后于室温条件下静置0.5 h，然后置于4 ℃离心机3 000 r/min离心15 min，吸取并收集上清，分装置于-80 ℃冰箱，或采用大鼠ELISA试剂盒检测大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。

1.7 组织病理学观察 大鼠脱颈椎处死，分离并收集大鼠膝关节滑膜组织，将组织切一小块放入10%福尔马林溶液，在室温下固定24 h。清洗大鼠组织标本，随后转移至EDTA脱钙液(0.5 M，pH 8)，在37 ℃条件下脱钙6周，脱钙期间隔3 d换1次液，将脱钙的组织石蜡包埋，使用石蜡切片机将包埋组织切成4 μm薄片，最后苏木精-伊红(HE)和番红固绿染色，显微镜观察并拍照。

1.8 蛋白免疫印迹(Western blot)法 大鼠脱颈椎处死，分离并收集大鼠膝关节滑膜组织，称一定量置于1.5 ml EP管，随后加入少许蛋白裂解液，研磨仪组织匀浆，置于4 ℃离心机12 000 r/min离心15 min，吸取上清，BCA法蛋白定量，加入loading buffer(4×)于100 ℃煮沸，分装储存于-20 ℃冰箱或直接上样用SDS-PAGE电泳分离蛋白，首先用80 V电压跑胶30 min，待样品进入分离胶后，用120 V电压跑胶60 min。根据分离蛋白分子量不同，采用适当转膜条件将分离后的蛋白从胶转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBS缓冲液(含0.1%吐温)室温洗涤3次，5 min/次，随后使用稀释后的一抗(Nrf2、HO-1、SIRT1、AMPK和β-actin，按1∶1 000稀释；p-AMPK，按1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，TBS缓冲液(含0.1%吐温)洗膜5次，5 min/次，用HRP标记山羊抗兔IG和HRP标记山羊抗鼠IG(按1∶20 000稀释)室温条件下置于摇床孵育90 min，最后用增强型化学发光试剂显影反应，并置于成像系统获取目的条带图像。

2 结果

2.1 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠关节炎评分和机械性痛阈的影响 模型组大鼠的关节炎指数较假手术组明显增加；玫瑰树碱中剂量、高剂量和阳性对照组大鼠的关节炎指数较模型组均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图1A)。PWT结果表明，模型组大鼠的机械性痛阈值较假手术组明显降低，玫瑰树碱各剂量组和阳性对照组大鼠的机械性痛阈值较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，见图1B)。

图1 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠关节炎指数和机械性痛阈值的影响注：A.骨关节炎大鼠的关节炎评分；B.骨关节炎大鼠的机械性痛阈值。与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠血清中炎症细胞因子的影响 模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；玫瑰树碱各剂量组和阳性对照组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠血清中炎症细胞因子的影响注：A.骨关节炎大鼠血清中IL-1β含量；B.骨关节炎大鼠血清中IL-6含量；C.骨关节炎大鼠血清中TNF-α含量。与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

2.3 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠骨关节病理学形态的影响 见图3。模型组大鼠的关节软骨较假手术组薄，软骨细胞的数量显著减少，番红固绿染色发现软骨聚糖有所损失。与模型组比较，玫瑰树碱各剂量组和阳性对照组大鼠的关节软骨较模型组增厚，并且软骨细胞和蛋白聚糖增加。

2.4 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠滑膜组织中Nrf2信号蛋白表达的影响 模型组大鼠滑膜组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平高于假手术组(P<0.05)；玫瑰树碱各剂量组和阳性对照组大鼠滑膜组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平高于模型组(P<0.05)。见图4、表1。

图4 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠滑膜组织中Nrf2信号蛋白表达的影响

表1 蛋白免疫印迹条带统计结果

2.5 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠滑膜组织中SIRT1信号蛋白表达的影响 模型组大鼠滑膜组织中SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表达水平较假手术组明显减少；玫瑰树碱各剂量组和阳性对照组大鼠滑膜组织中SIRT1和p-AMPK/AMPK蛋白表达水平较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、表1。

图5 玫瑰树碱对骨关节炎大鼠滑膜组织中SIRT1信号蛋白表达的影响

3 讨论

骨关节炎的临床症状特点主要为慢性关节疼痛、肿胀以及活动受限，严重影响患者的生活质量[10-11]。膝关节前交叉韧带术能够建立骨关节炎动物模型，表现骨关节炎的临床特点，因此被广泛应用于骨关节炎的病理和药物研究[11]。本研究首先采用膝关节前交叉韧带术建立骨关节炎大鼠模型，结果表明,模型组大鼠关节炎症状明显，主要是关节肿胀和疼痛。此外，玫瑰树碱对骨关节炎大鼠的关节肿胀和疼痛具有缓解效应，说明玫瑰树碱是一种潜在的治疗骨关节炎的药物。

骨关节炎的病理特点主要表现为软骨基质降解、滑膜炎和软骨细胞减少等[12]。本研究病理染色发现，骨关节炎大鼠出现了明显的关节炎症状，包括基质降解，表现为软骨表面侵蚀、较薄的软骨和蛋白聚糖损失。玫瑰树碱治疗后，软骨表面完整，软骨细胞和蛋白多糖减少明显缓解，表明玫瑰树碱能够缓解骨关节炎大鼠的软骨基质降解。滑膜炎与骨关节疾病的疼痛和肿胀直接相关，病理条件下，炎性细胞能够大量浸润关节滑膜，进而释放大量的炎症细胞因子、趋化因子以及蛋白酶，引起关节基质降解和骨质破坏，促使关节炎的发生和发展[13]。骨关节炎病理变化过程涉及大量的促炎细胞因子，IL-1β、TNF-α和IL-6尤为关键[14-15]。本研究发现，玫瑰树碱能够抑制骨关节炎大鼠血清中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的释放。

Nrf2信号通路主要负责细胞抵抗氧化应激和生理上维持细胞氧化还原平衡。一些研究表明，Nrf2信号在调节炎症反应中起关键作用，其功能障碍表现为对炎症疾病的易感性[16]。Nrf2是调节抗氧化基因(包括HO-1)表达的转录因子，Nrf2/HO-1信号在炎症疾病的病理变化过程中具有重要影响[17]。Nrf2敲除小鼠的关节基质出现严重损伤，提示Nrf2/HO-1信号是骨关节炎治疗的潜在靶点[18]。本研究发现，玫瑰树碱能够上调Nrf2和HO-1蛋白表达，激活骨关节炎大鼠滑膜组织中Nrf2信号。有报道，SIRT1能够抑制炎症反应，还能够调节Nrf2/HO-1信号活化[19]。同时，SIRT1的激活可以增加骨关节炎患者软骨细胞中软骨特异性基因SOX9的表达、聚集蛋白聚糖和胶原蛋白[20]。SIRT1还可以通过下调蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)或增加Bcl-2的表达来调节人软骨细胞的凋亡[21]。SIRT1能够通过使蛋白激酶RNA样的ER激酶(PERK)脱乙酰化并减弱PERK-eIF-2α-CHOP轴，促进软骨形成和骨纵向生长，SIRT1的激活和抑制也可以调节AMPK的活性[22]。本研究发现，玫瑰树碱上调SIRT1蛋白的表达以及AMPK磷酸化，激活SIRT1信号通路。上述结果表明，玫瑰树碱能够调节骨关节炎大鼠滑膜组织中SIRT1-Nrf2信号活化，参与骨关节炎的治疗作用。

综上所述，玫瑰树碱能够缓解骨关节炎症状和病理损伤，并且可能与激活滑膜组织中SIRT1-Nrf2信号通路有关。但玫瑰树碱对SIRT1-Nrf2信号通路激活是否是直接作用，仍需进一步研究。

致谢：感谢川北医学院基础医学院吴旦老师在动物实验上给予的支持和帮助