河南产区丹参根腐病病原鉴定

杨 瑾，文 艺，高素霞，刘玉霞，鲁传涛，王 飞，刘红彦

（1. 河南中医药大学药学院，河南郑州 450046；2. 河南省农业科学院植物保护研究所，河南郑州 450002）

丹参（Salvia miltiorrhizaBge.）为唇形科多年生草本植物，以干燥根和根茎入药，具有活血调经、消肿止痛、镇静安神等功效；药理研究表明，丹参具有显著的抗炎、抗血栓作用[1]，是治疗心脑血管疾病的常用药物之一。丹参主要产于河南、山东、四川、陕西、安徽、湖北等地[2]。河南省丹参种植面积约2万hm2，随着人工种植面积的扩大，病害问题日益加剧，根腐病、枯萎病、根结线虫病、白绢病等土传病害发生且逐年加重[3‑8]。其中，丹参根腐病在丹参整个生长期均可发生，主要危害丹参根部，导致丹参品质和产量下降，严重时导致绝产，已成为危害丹参生产的主要病害[9]。

丹参根腐病的病原在不同丹参产区有所差异，尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）能够侵染丹参根部并造成枯萎和根腐症状，腐皮镰孢菌（F. solani）是引起山东、四川丹参根腐病的优势病原菌，而引起陕西商洛丹参根腐病的病原菌主要是镰孢属真菌（Fusariumsp.）和1 种分类地位还不能完全确定的病菌[2‑5]。前期调查发现，河南省丹参种植区丹参根腐病田块发病率达100%，严重降低了丹参的产量，但有关其病原的研究尚未见报道。鉴于此，对河南丹参产区丹参根腐病的病原种类进行系统地鉴定，旨在为丹参根腐病的防治提供技术支持和理论依据。

1 材料和方法

1.1 丹参根腐病田间调查及取样

2018—2019 年在河南省禹州、渑池、方城、嵩县4 个丹参产区调查根腐病的发生情况，共调查16 块丹参田，其中渑池和嵩县各有一块丹参连作3 a 的田块。每块田采用五点取样法，每点调查20 m2，统计丹参根腐病的发病率，描述症状并采集样品，共取丹参根腐病样品30份。

1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，琼脂18 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

1.3 丹参根腐病病原菌分离及纯化

采用组织分离法[10]进行病原菌分离，选取具有典型根腐病症状的样品，在病健交界处切取5 mm×5 mm 大小的组织块，用75%乙醇消毒10～15 s，5%次氯酸钠消毒3 min，无菌水冲洗3 遍，用灭菌滤纸吸干，接种在含有硫酸链霉素（50 μg/mL）的PDA 培养基上，28 ℃培养3 d。分离物多次纯化后保存于25%甘油，置于-80 ℃冰箱待用。

1.4 柯赫氏法则验证

1.4.1 离体接种 采用根段接种法[11]，选取健康丹参根，无菌水冲洗干净，切成长5 cm 的根段，放在铺有滤纸的培养皿中，每皿放置1个根段，用手术刀在根段中间划一道伤口，将培养7 d 的分离物用打孔器打取直径为8 mm 菌饼，接种于伤口。每个分离物重复3 皿，以接种PDA 琼脂块为对照（CK），28 ℃保湿培养7 d，观察发病情况。

1.4.2 盆栽接种 将纯化培养的病原菌在PDA 上培养5 d，无菌水冲洗后制成1×106个/mL 的分生孢子悬液，将孢子液灌入盆栽45 d 的丹参根部，每株接种20 mL，每个病原菌接种8 盆，其中4 盆进行根部切伤，4 盆进行无伤接种，设置无菌水接种作对照。接种后，记录发病时间、发病率和症状表现，并对不同菌株的致病力进行评价。

致病力标准[12]如下：

强致病力菌株：伤根及未伤根接种均发病，地上部分枯萎，主根和须根腐烂数大于总根数的1/2，且发病率>75%；中级致病力菌株：伤根及未伤根接种均发病，主根和须根腐烂占总根数的1/4～1/2，发病率>50%且≤75%；弱致病力菌株：伤根及未伤根接种均发病，主根和须根腐烂占总根数的1/4，发病率≤50%；条件致病菌：只有伤根接种的植株发病。

从接种后发病的丹参根部再次进行病原分离，将分离物与接种菌株进行一致性比对，完成柯赫氏法则验证。

1.5 病原菌鉴定

1.5.1 形态鉴定 将纯化的病原菌接种在PDA 平板上，28 ℃下培养5 d，描述菌落形态，并在显微镜下观察产孢结构和分生孢子形态，测量分生孢子的大小，并与文献[13]描述进行比对。

1.5.2 分子鉴定 采用CTAB 法提取菌丝DNA，利用真菌rDNA-ITS 区ITS1/4 引物[14]对其进行PCR 扩增和测序，将获得的镰孢菌属菌株ITS 序列在Fusarium-ID 数据库中进行BLAST 比对，使用延伸因子EF-1α 引物（EF1/2）[15]和层出镰孢菌特异性引物PRO1/2[16]对镰孢菌种类做进一步鉴定，并上传序列，获得登录号。

2 结果与分析

2.1 丹参根腐病的田间调查情况

2018—2019 年，河南省禹州、渑池、方城、嵩县共16 块丹参田根腐病的田块发病率为100%，病株率在3.5%～85.0%。禹州、渑池、方城、嵩县4 个丹参产区丹参根腐病的平均病株率分别为7.2%、34.2%、32.2%、37.1%；连作田块发病最重，病株率达到了85.0%。初发病时丹参地上部植株僵化矮小，叶片边缘紫红色，后变为黄色，最后枯死脱落，叶片脱落后，茎秆逐渐枯死，急性症状表现为茎秆与叶片同时干枯，地下部分须根先发病变褐、腐烂，蔓延导致主根变褐，最后呈干腐状。在叶片发黄时期，对茎秆解剖后可见髓部变褐，主根上也能发现木纤维变褐（图1）。河南产区丹参根腐病在6—8 月高温、高湿季节为盛发期，透气性差的黏性土壤病株率高。

图1 丹参根腐病的田间症状Fig.1 Symptoms of root rot on S.miltiorrhiza in the field

2.2 丹参根腐病病原菌的分离纯化

将从4 个产区采样并经分离获得的30 个菌株多次纯化后编号为F1—F30，按照菌落形态分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（表1）。其中，Ⅰ类菌落为圆形，菌丝羊毛状，气生菌丝淡紫色，产淡紫色色素；Ⅱ类菌落为圆形，菌丝丛卷毛状、稀疏、白色，不产色素；Ⅲ类形态为圆形，菌丝体具条纹，绒毛状，中间稀疏并贴培养基生长，产淡紫色色素。

表1 丹参根腐病分离菌株的来源及形态类别Tab.1 Source information and morphological classification of strains of root rot on S.miltiorrhiza

2.3 柯赫氏法则验证结果

2.3.1 离体接种 F2、F15 和F21 菌株接种7 d，丹参根开始变褐、腐烂，14 d 后整个根段长满菌丝并完全腐烂；F1、F5、F8、F14、F17 和F25 菌株接种7 d，丹参根出现根裂现象，14 d 后根部变褐（图2）；其余菌株接种后未发病。结果表明，F1、F2、F5、F8、F14、F15、F17、F21、F25共9株菌株对丹参有致病性。

图2 9株致病菌株对丹参根段离体接种结果Fig.2 The in vitro infection of nine pathogenic strains on S.miltiorrhiza roots

2.3.2 盆栽接种 对照丹参植株正常生长，主根呈鲜红色（图3A）。接种F1、F2、F5菌株的致病症状相同，伤根处理组显症时间依次为19、14、18 d，发病率分别为50%、75%、50%，发病初期叶片发黄萎蔫，接种后45 d 地上部一侧枯萎，须根腐烂，主根发黑腐烂（图3B），接种F1 和F5 菌株的丹参植株主根腐烂数占1/4，接种F2 菌株的丹参植株主根腐烂数占1/2；未伤根处理组显症时间分别为34、30、32 d。接种菌株F8、F14、F15、F17、F21 的致病症状相同，伤根处理组显症时间依次为18、18、19、17、14 d，发病率分别为50%、50%、50%、75%、100%，发病初期叶缘向背面翻卷，叶片由紫红色逐渐变黄，接种后45 d 地上部全部枯萎，茎基部发黑，植株生长缓慢，伤根一侧逐渐枯萎甚至死亡，须根腐烂（图3C），接种F8、F14 和F15 的丹参植株主根腐烂数占1/4，接种F17 盆栽丹参植株主根腐烂数占1/2，接种F21 的丹参植株主根腐烂数占3/4；未伤根处理组显症时间分别为34、33、33、31、30 d。菌株F25伤根处理后第20 天开始显症，发病率为25%，一侧叶片由紫红色逐渐变黄，接种后45 d 植株茎基部发黑，植株生长缓慢，部分须根腐烂，主根黄白色（图3D）；不伤根处理植株未发病。综合比较伤根及未伤根处理组显症时间、发病程度和病株率发现，F21为强致病力菌株，F2、F17 为中级致病力菌株，F1、F5、F8、F14、F15为弱致病力菌株，F25为条件性致病菌。

图3 盆栽丹参接种病原菌45 d后的症状Fig.3 Symptoms of potted S.miltiorrhiza inoculated with pathogenic strains 45 d later

从以上接种植株的发病部位再次分离获得的病原菌，与接种前病原菌形态一致，完成柯赫氏法则验证，可以确定F1、F2、F5、F8、F14、F15、F17、F21、F25共9株菌株均为丹参根腐病的病原。

2.4 丹参根腐病病原菌鉴定

2.4.1 形态学鉴定 菌株F1、F2 和F5 在PDA 培养基上菌落为圆形，菌丝羊毛状，气生菌丝淡紫色，产淡紫色色素（图4A）；大型分生孢子罕见，呈细长镰刀形（21.79～32.68 μm×2.62～4.25 μm），小型分生孢子假头状，棒形（4.38～12.36 μm×2.13～3.52 μm），无厚垣孢子（图4B、C），符合镰孢菌属（Fusarium）真菌特征。

菌株F8、F14、F15、F17 和F21 在PDA 培养基上菌落为圆形，菌丝丛卷毛状、稀疏、白色，不产色素（图4D），产镰刀状大型分生孢子（37.02～54.62 μm×4.62～5.29 μm）和卵圆形小型分生孢子（8.93～16.96 μm×2.41～3.28 μm），小型分生孢子居多，呈假头状，产孢细胞单瓶梗（图4E、F），符合腐皮镰孢菌（F.solani）的特征。

菌株F25菌落形态为圆形，菌丝体具条纹，绒毛状，中间稀疏并贴培养基生长，产淡紫色色素（图4G），产镰刀状大型分生孢子（27.95～56.58 μm ×3.51～4.72 μm）和卵圆形小型分生孢子（4.23～10.96 μm × 2.53～3.38 μm），着生于侧生瓶状小梗上（图4H、I），符合尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的特征。

图4 菌株F1（A—C）、F8（D—E）、F25（G—I）的菌落形态及分生孢子特征Fig.4 Colony and spores morphological characteristics of isolaties F1（A—C），F8（D—E），F25（G—I）

2.4.2 分子生物学鉴定

2.4.2.1 rDNA-ITS 序列比对分析 F8、F14、F15、F17 和F21（NCBI 收录号为MT371372、MT371374、MT371375、MT371377、MT371378）与Fusarium-ID数据库中登录号为FD 01865 的Fusarium solani同源性达到98%。菌株F1、F2、F5 和F25 仅能比对到镰孢菌属而无法确定具体的种。

2.4.2.2 EF-1α 序列比对分析 将引物EF1/2 扩增出的序列在Fusarium-ID 数据库中比对并构建进化树（图5），发现F1、F5（NCBI 收录号为MT371382、MT371387）与F. proliferatum（FD 01389）亲缘关系支持率为96%，F2（NCBI 收录号为MT371384）与F.proliferatum（FD 01379）亲缘关系支持率为89%。F8（NCBI 收录号为MT371383）与F. solani（FD 01472）亲缘关系支持率为87%，F14、F15、F17（NCBI收录号为MT371385、MT371386、MT371388）与F.solani（FD 01458）亲缘关系支持率达到93%，F21（NCBI 收录号为MT371389）与F. solani（FD 01489）亲缘关系支持率达到92%，F25（NCBI 收录号为MT371390）与F. oxysporum（FD 00791）亲缘关系支持率达到100%。

图5 基于EF-1α序列镰孢菌属的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on EF-1α sequence of Fusarium species

2.4.2.3 特异性引物（PRO1/2）验证 以F21 为对照，利用层出镰孢菌特异性引物（PRO1/2）对F1、F2、F5 菌株的DNA 进行扩增，结果显示，F1、F2、F5菌株均能扩增出1 个550 bp 的片段，F21 菌株未扩增出条带（图6）。

图6 层出镰孢菌特异性引物PRO1/2扩增产物电泳图谱Fig.6 Electrophoretogram of DNA products amplified by PCR-primer PRO1/2 from F.proliferatum DNA

结合形态学与分子生物学鉴定结果，确定了F1、F2、F5 均为F. proliferatum，F8、F14、F15、F21 均为F.solani，F25为F.oxysporum。

3 结论与讨论

镰孢菌属真菌在自然界中分布广泛，可侵染多种作物引起枯萎病或根腐病[17‑21]，在其分子鉴定中，rDNA-ITS 和EF-1α 2 个位点应用最多[22]，与ITS 序列相比，EF-1α 对镰孢菌属内亲缘关系近的种有更高的鉴别力[23‑24]。本研究结合病原菌形态和分子鉴定以及柯赫氏法则验证，确定了引起河南产区丹参根腐病的病原为F.solani、F.proliferatum和F.oxysporum，其中F.proliferatum侵染丹参造成根腐病是首次报道，为丹参根腐病病原研究提供了基础。

不同地区分离出的致病菌种类不同，且同一产区有多种病原，说明不同产区丹参根腐病病原分布存在差异，且存在复合侵染的现象。通过回接验证发现，不同病原菌致病力存在差异，由强到弱分别为F. solani、F. proliferatum、F. oxysporum，同种病原菌不同菌株的致病力也存在差异。

伤根接种比非伤根接种发病快、症状严重。因此，农事操作和地下害虫对丹参根部的伤害可能加重丹参根腐病的发生程度。丹参连作地块，根腐病的发病率高达85.0%，明确了根腐病的发生是丹参连作障碍的重要因素之一。6—8月雨水较多，为丹参根腐病发病盛期，土壤黏重的地块发病率高，因此种植丹参应避免田间积水。

本研究对河南不同产区丹参根腐病进行了系统调查，为丹参根腐病的诊断和防治提供了依据，但根腐病病原种类分布、复合侵染和致病力差异方面还需进一步研究。