香烟烟雾诱导小鼠COPD模型B细胞免疫与气流受限的研究

陈茜 陈瑞

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃nary disease，COPD），是一种常见的、可预防可治疗的疾病，常与吸入有毒颗粒或有害气体有关，多引起气道和/或肺泡异常，导致持续的呼吸道症状和气流受限［1］。香烟烟雾暴露与COPD 发病相关［2］。

既往的研究多探讨COPD 与固有免疫和T 细胞免疫的关系，而B 细胞免疫与COPD 的相关研究较少。本研究通过烟熏法构建小鼠COPD 模型，采用免疫组化和流式细胞术检测肺组织及脾脏中B细胞变化，探讨香烟烟雾诱导的B 细胞免疫改变在COPD 发病机制中的作用。

1 材料及方法

1.1 实验动物与材料（1）动物来源：5 周龄SPF级C57BL/6小鼠采购自广州中医药大学实验动物中心；（2）红梅牌香烟；（3）试剂：PRMI⁃1640，DNaseⅠ和胶原酶Ⅱ，BAFF ELISA 检测试剂盒，CD19、B220、CD138 抗体。

1.2 建模及标本处理（1）小鼠COPD 模型构建将12 只小鼠随机分为对照组（CON 组）和烟熏组（CS 组）。CS 组小鼠放入烟熏箱，每天4 次，每次10 支香烟熏1 小时，共20 周。（2）小鼠体重称量小鼠进行体重称量（精确到0.01 g）。（3）肺功能检测在小鼠腹腔注射阿佛丁（0.4-0.75 mg/g）麻醉后，气管插管连接小动物活体肺功能检测仪（DSI BuxcoFinePointe；Whole Body Plethysmography，美国）进行肺功能检测。（4）肺泡灌洗液（BALF）的收集气管插管后用0.4 ml PBS 灌注右肺6 次，收集BALF，离心后进行细胞沉淀计数。（5）肺组织的处理液氮研磨提取肺组织蛋白，ELISA 检测BAFF 含量；肺组织固定石蜡包埋，切片后行HE染色和免疫组化，检测CD19 阳性细胞。（6）脾脏细胞悬液流式细胞术将新鲜脾脏消化为单细胞悬液，流式抗体孵育30 min 后，在Cytoflex 仪上行流式检测CD19、B220 和CD138 阳性细胞（Beck⁃man，美国）。

1.3 统计学分析采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间相互比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 COPD 小鼠模型构建CS 组小鼠精神萎靡、活动量及食欲减退、生长发育缓慢、毛发晦暗枯黄、呼吸道分泌物增多等。CON 组小鼠生长发育平稳、未见明显呼吸道分泌物。CS 组小鼠体重显著低于CON 组小鼠下降（P<0.05）。

2.2 肺功能指标见表1。

2.3 肺组织HE 染色、B 细胞变化肺组织HE 染色与CON 组相比，CS 组小鼠肺部炎性细胞浸润增多，有明显的肺泡结构破坏（图1A⁃D）。肺组织免疫组化在肺泡周围区，CS 组CD19 阳性细胞明显增多（图1E⁃H）。

2.4 肺组织BAFF 水平CS 组小鼠肺组织BAFF表达水平较CON 组显著增多（P<0.05，图2⁃A）。

2.5 BALF 细胞数目与CON 组相比，CS 组BALF 细胞数目显著增高（P<0.05，图2⁃B）。

2.6 脾脏B 细胞的变化与CON 组相比，CS 组脾脏中CD19+B220-CD138+浆细胞显著升高；CD19+B220+B 细胞显著减少（P<0.05），CD19+B220+B 细胞数量与FEV20/FVC 呈高度正相关（P<0.01，图3）。

3 讨 论

香烟烟雾含多种毒害化学物，可增加病原体易感性或暴露自身抗原。烟熏法是构建小鼠COPD 模型的经典方法［3］。本研究采用烟熏法构建COPD 小鼠模型，CS 组小鼠一般状态更差、体重减轻、肺功能指标异常、肺组织出现病理结构改变，与文献报道类似，提示建模成功。

Polverino 等研究表明COPD 患者肺组织中B 细胞、富含B 细胞的淋巴滤泡增多［4，5］，B 细胞增加与肺气肿严重程度显著相关；John⁃Schuster 报道烟雾暴露的B 细胞缺陷小鼠肺气肿改变减少（6），提示B 细胞免疫可能在COPD 发病中起作用。目前的研究多探讨COPD 外周血和肺组织中的B 细胞免疫反应，脾脏这个重要的淋巴器官中B 细胞免疫反应如何，目前相关的文献报道极少。

脾脏是机体发生特异性免疫的主要场所，富含巨噬细胞和淋巴细胞。脾脏B 细胞接受抗原信号后活化分化浆细胞。本研究中CS 组脾脏CD19+B220+B 细胞表达量显著减少；CD19+B220⁃CD138+浆细胞表达量显著升高；B 细胞与FEV20/FVC 呈高度正相关性，提示香烟烟雾刺激可以使脾脏B 细胞活化分化为浆细胞增多；香烟烟雾诱导的脾脏B 细胞数量减少可能与COPD 气流受限有关。

B 细胞激活因子（BAFF）属于肿瘤坏死因子配体超家族成员，在B 细胞存活和发育中起重要作用。本研究中CS 组肺泡周围区B 细胞增多，BAFF表达增高，提示B 细胞增多可能与BAFF 有关，与Polverino 等人研究结果一致［4］。Morissette 等人报道表明在COPD 患者的外周血和肺组织中检测到自身抗体［7］，但是他们并没有进一步阐述自身抗体产生的机制。本研究中CS 组脾脏浆细胞显著增加，我们推测浆细胞增加可能与肺组织自身抗体的产生有关。

有趣的是，脾脏B 细胞改变与气流受限有关；而肺部B 细胞数量增多。这可能与香烟烟雾暴露抑制适应性免疫反应；而肺部的持续炎症激活外周淋巴器官，募集B 细胞，与前人研究一致［8］。

综上所述，香烟烟雾可以诱导小鼠脾脏和肺部B 细胞免疫应答的改变；脾脏B 细胞减少与气流受限密切相关；提示香烟烟雾刺激可以使脾脏B 细胞活化分化为浆细胞增多。本研究有助于更进一步认识B 细胞免疫在COPD 在气流受限中的作用，为临床COPD 治疗开辟新思路。