MyHC-2a基因在不同比例花椒籽饲喂育肥猪的组织差异表达分析

张亚丽，郭顺萍，尚学峰，李 杰，黄晓宇,2，滚双宝,2*

（1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省现代养猪工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070）

近年来，受非洲猪瘟疫情的影响，我国猪肉价格一路飙升，养猪业作为我国畜牧业的支柱性产业，受到了越来越多的关注。随着我国畜牧业的集约化、规模化发展，饲料原料成为制约养猪业发展的主要因素。我国作为世界上花椒种植规模最大、种类最全的国家，拥有大量的花椒资源。花椒作为植物性饲料，分为花椒果皮和花椒籽两部分，花椒果皮是人们常用的食用调料，可以被充分利用，然而花椒籽作为花椒生产的主要副产物，并没有得到充分利用，大量的花椒籽被随意丢弃，造成了资源浪费。花椒籽营养物质含量丰富，油脂和蛋白质含量高，是一种优质的饲料资源。目前，已有试验证实用5%的花椒籽代替玉米作为能量饲料，对育肥猪生长性能和胴体品质具有积极作用。

肌纤维是肌肉的基本组成单位，主要由肌球蛋白和肌动蛋白构成，肌球蛋白由4条轻链（MLC）和2条重链（MyHC）构成，猪的肌纤维根据肌球蛋白重链（MyHC）的多态性可分为1、2a、2b和2x四种类型，在代谢上分别与慢速氧化型、快速氧化型、快速酵解型和中间类型相对应[1]。还有学者将肌纤维分为两类，即氧化型和酵解型。氧化型肌纤维含有的细胞色素、线粒体和肌红蛋白多，又被称为红肌纤维，酵解型的肌纤维中细胞色素、线粒体和肌红蛋白少，被称为白肌纤维。肌纤维类型及组成不仅决定猪骨骼肌的生长发育类型，而且影响猪肉的生物化学性质和感官品质，是预测家畜肉质性状的常用指标[2]。以往学者应用实时荧光定量技术比较了中国地方品种猪和引入猪种4种MyHC亚型mRNA在猪背最长肌和半膜肌中的表达水平差异性，初步揭示了肌纤维类型的组成和表达量对猪肉品质具有内在的影响作用，揭示了品种的特性[3]。也有学者通过研究得出猪的腰大肌与背最长肌相比，具有相对丰富的2a型和2x型肌纤维，拥有更少量的2b型肌纤维，因而肉的品质更佳[4]。本试验研究猪MyHC-2a基因的调控机制，通过荧光定量技术研究其在不同比例花椒籽饲喂的育肥猪各组织中的表达情况，为花椒籽作为猪饲料的应用、今后猪肉品质的改良和育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

以甘肃农业大学动物科学技术学院动物遗传繁殖实验室保存的试验组和对照组生长育肥猪的心、肝、脾、肺、肾、背肌等组织样品作为试验样品。具体试验过程如下：试验选择健康的90日龄杜×（长×大）三元猪288头，预试验7 d，随机分为4组，每组4个重复，每个重复18头，以饲喂基础日粮为对照组，花椒籽等量代替2.5%、5%、7.5%的玉米饲粮，分别作为试验组Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，饲喂期100 d，自由采食，饲喂期满，屠宰。宰杀后，在无菌条件下，采集试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和对照组的各组织样品备用，迅速放于液氮中，保存在实验室-80℃冰箱中。

1.2 主要试剂、耗材

Trizol试剂，PrimeScript ™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，育肥猪各组织的cDNA，MyHC-2a基因的上下游引物，无酶水，内参等。

1.3 引物设计与合成

以GenBank中猪MyHC-2a基因核苷酸序列和氨基酸序列（NM_214136.1和NP_999301.1）为参考，采用NCBI中的Primer Premier 5.0设计MyHC-2a基因的荧光定量PCR特异性引物，引物由金唯智生物公司合成，引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物设计

1.4 总RNA提取和cDNA合成

采用Trizol萃取法提取试验组和对照组育肥猪的心、肝、脾、肺、肾和背肌等组织的总RNA，运用琼脂糖凝胶电泳实验和微量分光光度计分别检测RNA的完整性和纯度，将得到的cDNA保存在实验室-20℃的冰箱中。

1.5 实时荧光定量PCR

实时荧光定量反应体系为20 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，SYBR酶10 μl，RNase Free H2O补足至20 μl。荧光定量反应条件为95℃，5 min；94℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35个循环。每个组织做4个样品，每个样品同批次做3个复孔。以2-ΔΔCt法计算相对表达量，数据用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，表达量的结果均以平均数±标准差表示，最终结果通过Graphpad Prism 8.0以图片的形式展现出来。

2 结果与分析

2.1 基因扩增曲线

通过图1和图2可以得知，MyHC-2a基因和内参基因在扩增时，指数期条带走向一致且清晰，由此说明cDNA的浓度合适，适用于该试验进行荧光定量分析。

图1 MyHC-2a基因的扩增曲线

图2 内参基因的扩增曲线

2.2 基因溶解曲线

通过图3和图4可知，MyHC-2a基因和内参基因的溶解曲线的多个重复均曲线一致性较好，没有多余的杂带出现，证明试验设计的引物良好，适合后续的试验分析。

图3 MyHC-2a基因的溶解曲线

图4 内参基因的溶解曲线

2.3 MyHC-2a基因在不同组织中的表达分析

采用qPCR方法检测对照组、试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组育肥猪各组织中MyHC-2a基因的表达情况。结果表明：在育肥猪的脾和肺组织中，试验Ⅰ组中MyHC-2a基因的表达量均显著高于对照组、试验Ⅱ组和Ⅲ组，对照组MyHC-2a基因的表达量显著高于试验Ⅱ组和Ⅲ组，而试验Ⅱ组和Ⅲ组MyHC-2a基因的表达量差异不明显；在育肥猪的心、肾和背肌等组织中，对照组MyHC-2a基因的表达量均显著高于试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，其中心组织中试验Ⅰ组MyHC-2a基因的表达量高于试验Ⅱ组和Ⅲ组，而试验Ⅱ组和Ⅲ组MyHC-2a基因的表达量差异不明显。在肾和背肌中，试验Ⅰ组和Ⅲ组MyHC-2a基因的表达量显著高于试验Ⅱ组，但试验Ⅰ组和Ⅲ组MyHC-2a基因的表达量差异不明显；在育肥猪的肝组织中，对照组MyHC-2a基因的表达量均显著高于试验Ⅱ组和Ⅲ组，试验Ⅱ组和Ⅲ组MyHC-2a基因的表达量差异不明显（见图5）。

图5 对照组和试验组育肥猪的不同组织中MyHC-2a基因的表达分析

3 讨论

花椒作为优质的饲料资源，拥有丰富的油脂和蛋白质等营养物质，且价格低廉，目前对于花椒籽的研究主要停留在蛋鸡方面，在生猪方面研究很少。鲜凌瑾研究表明，添加1.0%的花椒籽有利于雏鸡提高体重和饲料转化率[5]。付兴周等研究得出添加花椒籽粉能够减慢肌肉pH下降的速度，从而延长鲜肉的保存时间[6]。

肌肉中肌纤维类型组成对肌肉功能及屠宰后肉品质量产生重要影响，不同品种的猪肌肉组织因能量代谢方式不同，经常会导致肌纤维类型分布不同，进而造成肉品质差异较大[7]。有许多研究表明肌纤维的类型和组成会直接影响猪肉品质，营养和品种等因素不会影响肌纤维的数量，只会影响肌纤维的类型转化[8]。梁永飞等通过向生长育肥猪的饲料中添加一定比例的花椒籽实，得出添加花椒籽对育肥猪猪肉的肉色、脂肪酸结构改善具有积极作用[9]。本次试验结果表明：不同比例花椒籽饲喂育肥猪后，育肥猪的肝、脾和肺组织中MyHC-2a基因高表达，育肥猪的心和背肌组织中MyHC-2a基因低表达；在育肥猪的心、脾和肺等组织中，对照组和试验Ⅰ组MyHC-2a基因的表达量显著高于试验Ⅱ组和试验Ⅲ组；在育肥猪的肝组织中，对照组MyHC-2a基因的表达量显著高于试验Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，说明不添加花椒籽或添加2.5%的花椒籽有利于MyHC-2a基因的表达。MyHC-2a基因对应的是红肌纤维，杨海玲等研究表明，红肌纤维含量高的肌肉不易产生PSE肉且红肌纤维含有的脂类多，分解和积累脂肪的能力强，更易形成肥美多汁、品质优良的大理石花纹肉[10]。相类似的，欧秀琼等研究表明，肌肉品质与酵解型肌纤维含量的高低呈负相关，而氧化型肌纤维的含量越高，动物屠宰后胴体的肌肉颜色、风味和多汁性等品质越好[11]。辛雪等通过对巴美肉羊进行研究，得出MyHC-2a型肌纤维数量越多，肉质越软，剪切力越低[12]，Yanru Hou等人通过对蒙古羊的放牧组和禁闭组进行比较分析，也得到了相同的结果[13]。就肌纤维直径而言，氧化型肌纤维（如MyHC-2a型）直径较细，酵解型肌纤维（如MyHC-2b型）直径较粗[14]。肌纤维直径越小，面积越小，密度越大，肌肉剪切力越小，肉质越好[15]。这些结果均说明MyHC-2a型肌纤维的表达量对肉质的感官、色泽和口感都具有十分重要的作用。

4 结论

不添加花椒籽或添加2.5%的花椒籽有利于MyHC-2a基因的表达，添加5%或7.5%的花椒籽对MyHC-2a基因的表达有负面影响。本研究可为花椒籽的利用和将来深入探讨MyHC-2a基因在改良肉质和促进育肥猪肌肉的生长发育方面提供参考。