RP⁃HPLC法测定黄体酮注射液中苯甲醇的含量

李明珠，白 云，张鑫月，王先友

（河南大学 药学院，河南开封475004）

黄体酮注射液是黄体酮的灭菌茶油溶液，内含苯甲醇等辅料，其主要成分黄体酮的化学结构为孕甾⁃4⁃烯⁃3，20⁃二酮［1］。 苯甲醇通常作为增溶剂和防腐剂在黄体酮注射液生产中使用，而苯甲醇易氧化成苯甲醛，有较强的毒性［2－4］，对人体具有危害性，比如对中枢神经系统的毒性作用主要表现为记忆力减退、头痛头晕、疲劳无力、视力模糊、恶心呕吐、步态不稳以及手脚发麻等症状［5］；对于身体机能尚未完善的新生儿来说，苯甲醇和其被氧化产物苯甲醛更容易透过血脑屏障，最终可能会导致新生儿中毒甚至死亡［6－7］。另外，肌肉注射苯甲醇过量会增大臀肌挛缩症的风险。2020版《中国药典》关于黄体酮注射液中苯甲醇的含量未作明确规定，只要求加入苯甲醇应适量，因此需要严格控制制剂中苯甲醇的含量［8］。本研究采用HPLC法测定黄体酮注射液中苯甲醇的含量，结果表明在同一色谱条件下可同时测定两种物质的含量，为其质量控制提供了一种简单便捷方法［9］。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200 C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 十万分之一电子天平：Sartorius BT125D。

乙腈：色谱纯；醋酸：分析纯；无水醋酸钠：分析纯；黄体酮注射液（市售，苯甲醇处方量：2%）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 样品溶液

精密量取黄体酮注射液1 mL，用甲醇振摇提取3次（每次3mL），每次振摇5 min后再离心10 min，将甲醇提取液移至10 mL容量瓶中，合并提取液。最后用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。

1.2.2 对照品溶液

精密量取苯甲醇对照品2 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得苯甲醇对照品溶液。

精密量取苯甲醛对照品0.2 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀作为贮备液（1）；精密量取1 mL贮备液（1）置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为贮备液（2）；精密量取1 mL贮备液（2）置于20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得苯甲醛对照品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent 1200 C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 流动相：醋酸⁃醋酸钠缓冲液（pH＝3.6）与乙腈体积比为 70 ∶30， 流速：1.0 mL／min， 柱温：30℃，λD＝ 254 nm， 进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性实验

按照上述色谱条件测定，得到对照品和样品色谱图如图1。苯甲醇的保留时间约为7.5 min，苯甲醛的保留时间约为14 min，分离度大于14，理论塔板数大于8 000。

图1 对照品溶液（a）和样品溶液（b）色谱图Fig.1 Chromatogram of reference solution （a）and Sample solution （b）

2.1.2 线性范围

精密量取苯甲醇对照品溶液适量，配制出浓度梯度约为 0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 μL／L 的对照品溶液，按照“1.3”色谱条件测定，线性回归，测得苯甲醇峰面积Y和浓度X的线性方程为Y＝1 661.2X＋24.036 （R2＝ 0.999 8）。 结果表明， 苯甲醇浓度在 0.01 ～ 0.03 μL／L 范围内， 线性关系良好。

2.1.3 系统精密度

取浓度为 0.020 μL／L的对照品溶液，按照上述色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，测得苯甲醇峰面积的RSD为0.14%。

2.1.4 供试品溶液稳定性

分别测定供试品溶液在 0、2、4、6、8、12 h 后的峰面积，测得苯甲醇的RSD为0.40%，证明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.5 重复性实验

取同一批黄体酮注射液，按照前述方法制备6份样品溶液，按“1.3”项下方法测定，测得苯甲醇含量的RSD值为1.2%，表明该方法的重复性良好。

2.1.6 回收率实验

取含量已知的黄体酮注射液适量，加入一定量的苯甲醇对照品适量，按照前述方法测定，计算出平均回收率为 99.26%，RSD＝ 1.1% （n＝6）。

2.2 样品中苯甲醇的含量测定

分别取三个批号的黄体酮注射液适量，按“1.2.1”项下方法制备供试品溶液， 按照上述色谱条件测定，三批含量结果见表1。

表1 样品中苯甲醇的含量Table 1 Content of benzyl alcohol in sample

各批样品检测结果与理论投料（苯甲醇处方量：2%）基本一致，符合标示量80% ～120%的要求。

2.3 苯甲醛的检查

苯甲醇易被氧化成苯甲醛，根据中国药典（2020版，二部）苯甲醇规定［10］，苯甲醇中苯甲醛的含量不能超过0.1%。在对黄体酮注射液中苯甲醇含量的分析过程中，发现有苯甲醛色谱峰，且苯甲醇与苯甲醛的色谱峰分离度大于14，因此可采用苯甲醇的色谱分析方法对苯甲醛的含量进行测定。

按照“1.2.2”项下操作制备苯甲醛对照品溶液，亦用外标对照法计算，结果显示苯甲醇中苯甲醛的相对含量在0.07% ～0.08%，其限度符合药典规定。经考察苯甲醛在0.5～5 μL／L范围内的峰面积Y和浓度X的线性方程为 Y＝ 3 285.2X＋53.643（R2＝0.998 6）。

3 结论

1）由实验数据可看出，本次实验方法简便、提取液干扰少、分离度高、重复性好，适合用于黄体酮注射液中苯甲醇的含量测定。

2）苯甲醇作为注射剂中最为常用的抑菌剂之一，连续的肌肉注射会使局部产生硬结从而影响药物吸收。因不同厂家的生产工艺不同，不同注射剂中苯甲醇的含量相差会较大。一般情况下，苯甲醇在注射剂中的加入量为1% ～2%［9］。从此次实验样品检测的结果来看，该样品不同批号的黄体酮注射液中苯甲醇的含量均符合规定。