对噬菌体、噬菌体内溶素和抗菌肽抗菌作用的应用研究

王 猛，金焱燕，蔡大敏，⋆，梅丰翌，张峰华，徐如嫣，张文翰

（1.天津市第一中心医院，天津 300192 ；2.杭州医学院，浙江 杭州 310000）

半个多世纪以来，人类一直使用抗生素治疗由各种致病菌引起的感染性疾病。相关的调查结果显示，滥用抗生素可增加对抗生素耐药菌株的数量，进而降低抗生素的疗效[1]。预计在不久的将来，因多种致病菌对抗生素抵抗，不仅会降低抗生素的疗效，还会增加手术感染的发生率，进而导致患者出现因常见感染而死亡的情况。相关的调查结果显示，近年来多种致病菌获得抗生素抗性的速度在不断地加快。有研究表明，将铜绿假单胞菌暴露在5 种常用抗生素中，并不断增加这5 种抗生素的浓度，铜绿假单胞菌会迅速产生抗生素抗性[2]。另外，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、碳青霉烯抗性肠杆菌、耐万古霉素肠球菌、多重耐药假单胞菌和不动杆菌等病原菌均已产生了抗生素抗性。相关的调查数据显示，抗生素耐药菌株的增加是导致医疗费用增多的重要原因之一[3]。鉴于上述情况，用于治疗由多重耐药（multiple drug resistance，MDR）菌株所致感染的新治疗策略亟待发掘。有研究表明，噬菌体、噬菌体内溶素和抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）均具有抗菌作用，其疗效均优于抗生素，很有希望解决MDR 所致感染的治疗问题。本次研究主要是从噬菌体、噬菌体内溶素、AMPs的抗菌作用机制方面探讨其在生物医学领域中的应用情况。

1 噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs的抗菌作用机制

1.1 噬菌体的抗菌作用机制

噬菌体的发现是微生物学中的重大事件之一。弗雷德里克·威廉·特罗特在英格兰（1915 年）、费利克斯·德赫勒在法国（1917 年）几乎同时发现了噬菌体。而噬菌体的裂解能力则是由英国细菌学家恩斯特·汉金在1896 年首次发现的[4]。噬菌体是地球上最常见的生物颗粒，其在生物圈中以1030-1032的数量出现，是现存的最大病毒群[5]。噬菌体是能够侵袭细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的一类病毒的总称。噬菌体可渗透到其宿主细菌的细胞内，引起特异性感染，使宿主细菌的细胞出现代谢紊乱而发生裂解，通过破坏宿主细菌的细胞起到抗菌作用。在2007 年，有5500 余种原核病毒通过电镜观察被发现，其中约有99.6%的原核病毒为噬菌体[6]。1967 年布拉德利首次对噬菌体进行了分类，其区分出了有尾噬菌体、三种等长噬菌体和烈性噬菌体三组噬菌体。有研究表明，约有96%的噬菌体为有尾噬菌体。而多面体噬菌体、多形性噬菌体及烈性噬菌体则很少见，其宿主细菌的范围也很窄[5]。随着电镜技术的不断发展，病毒的分类变得非常精确。目前，微生物学将噬菌体的分类方案规定为1 目13 科34 种[7]。按照衣壳中所发现遗传物质的类型，噬菌体可分为四大类：单链DNA 噬菌体、双链DNA 噬菌体、单链RNA 噬菌体和双链RNA 噬菌体。在宿主细菌进行复制的过程中，噬菌体以裂解循环(毒性噬菌体)或溶原循环(温和噬菌体)的形式发生。裂解循环的形式通常以新病毒粒子的产生和细菌的细胞受到破坏结束（发生裂解），唯一的例外是Inoviridae 家族中的烈性噬菌体可不经细胞裂解持续释放子代噬菌体。溶原循环的形式是在溶原状态下，噬菌体的基因组整合至细胞的DNA 中或以质粒的形式游离潜伏在细胞内，当细胞内环境的平衡被打破时，噬菌体产生及细胞裂解的阶段就开始了。毒性有尾噬菌体的生命周期是一个多步骤的过程，包括吸附阶段、细胞感染噬菌体DNA 阶段、噬菌体在细胞内增殖阶段和最后释放新的可感染噬菌体阶段[8]。噬菌体疗法是指通过噬菌体裂解对抗致病菌的一种治疗方法。该疗法可有效地抑制各种致病菌（包括对抗生素耐药的致病菌菌株）的活性，其主要特点是：1）与抗生素疗法的作用机制不同，该疗法具有特定的对抗致病菌所致感染的作用机制。2）该疗法的抗菌谱狭窄，可选择性地杀死宿主致病菌，且不会对机体内的其他微生物产生不良影响。3）噬菌体能够在发生感染的部位进行增殖[9]。使用噬菌体疗法对抗致病菌的优势是：1）噬菌体能够迅速地对对应出现的细菌突变体进行抵抗，这与噬菌体发生突变的频率远远高于细菌发生突变的频率有关。2）与使用抗生素相比，使用噬菌体疗法治疗感染性疾病的医疗成本更低。3）噬菌体疗法的副作用非常少见[10]。大量的研究结果证实，采用噬菌体疗法对抗耐药细菌具有巨大的潜力[11]。相关的调查数据显示，噬菌体产品的潜在应用领域不仅包括临床医学领域，还包括了食品领域和农业领域[12-13]。目前，噬菌体产品在食品安全领域已获得了美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的批准[14]。2006 年第一个噬菌体产品ListShield 注册上市。ListShield是由几种噬菌体组成的对抗单核增生李斯特菌的产品，而单核增生李斯特菌主要污染肉类产品和家禽类产品。另外，已经上市的噬菌体产品还有Listex P100和AgriPhage，这两种产品主要应用于对抗番茄和胡椒叶的细菌斑点。2008年FDA 第一次批准了噬菌体疗法的第一阶段临床试验。这些临床试验主要是将八种噬菌体混合，再将其用于对抗各种致病菌所致感染性疾病（如静脉性腿部溃疡合并金黄色葡萄球菌感染、铜绿假单胞菌感染和大肠杆菌感染等），最终的结果证实了噬菌体疗法的有效性和安全性，并为进一步开展噬菌体疗法的临床试验提供了可靠的参考[15]。但是，噬菌体疗法也存在以下问题：1）宿主细菌细胞的快速裂解，可能会导致大量内毒素的释放。2）缺乏部分噬菌体对毒素进行编码能力的相应药物动力学数据。3）宿主细菌免疫系统内的噬菌体易被中和。4）裂解后的噬菌体可向溶元噬菌体发生转化，致使宿主细菌对溶解噬菌体的攻击产生“抵抗力”，这可能会改变宿主细菌的毒性作用。

1.2 噬菌体内溶素的抗菌作用

噬菌体内溶素是指烈性噬菌体在裂解宿主细菌后期释放子代噬菌体的过程中产生的带有编码的一类蛋白，具有裂解细菌细胞壁的作用。噬菌体内溶素属于细菌的水解蛋白，能够破坏细菌细胞壁中的成分，使宿主细菌细胞释放噬菌体的后代。肽聚糖(peptidoglycan，PG) 是一种有能力编码的噬菌体水解酶的裂解酶，其用于感染和/ 或释放细菌宿主细胞的子代病毒颗粒。与噬菌体颗粒相关的PG 水解酶，可能会导致所谓的“从无裂解”，即裂解发生在没有完整裂解感染周期的情况下。PG 裂解的结构蛋白主要与噬菌体的尾部相关，可使局部细胞的细胞壁降解后引起感染。在宿主细菌细胞发生感染周期的后期，噬菌体可编码PG 水解酶，这属于细胞裂解过程的一部分。有研究表明，孔蛋白可导致细胞的细胞膜发生穿孔，使细胞质中积累的内溶蛋白获得PG，进而促进细菌细胞的裂解和子代噬菌体的释放。这类带有编码的PG 水解酶可使细菌细胞的内部发生裂解，被称为内溶素或细胞溶解酶[16]。噬菌体内溶素的结构与细菌细胞PG的结构密切相关。在革兰氏阴性细菌中，PG 主要以缺乏表面蛋白或碳水化合物的薄层形式存在。多数革兰阴性菌中的噬菌体产生的细胞溶解酶为球状蛋白。该蛋白的大小为15～20 kDa，仅由一个催化域组成。在革兰阳性菌中，噬菌体有一层厚厚的PG，其中含有交叉键、表面碳水化合物和蛋白质。革兰阳性菌的噬菌体内溶素具有一个（或多个）催化域和一个能够识别目标生物体细胞表面表位的结合域，常特异性地与菌株或物种相结合[17]。有研究表明，噬菌体内溶素通常连接催化域和结合域，是一个灵活的、跨结构域连接的序列[14]。噬菌体内溶素对细菌细胞的外源性作用是：可在没有高渗透压存在的情况下，诱导细菌细胞的裂解[18]。此项研究是将纯化的噬菌体内溶素作为对抗革兰阳性菌有效的抗菌剂的开始。革兰阴性菌因有细胞外膜的存在，通常需使用表面活性剂或其他额外机制允许的溶解酶穿过细胞的外膜。但是，相关的文献中也有关于将噬菌体细胞溶解酶与其他试剂融合后，产生对抗革兰阴性菌作用的报道[19]。

1.3 AMPs的抗菌作用机制

AMPs 是多数物种先天免疫反应的一个组成部分，其构成了生物体的固有免疫组成成分，具有广泛的抗菌活性。AMPs 几乎存在于所有的生物体中，即从细菌至植物、无脊椎动物和脊椎动物的生物体中[20]。目前，已有数百种的天然 AMPs 被分离出来[21]。AMPs 具有免疫调节的特性，对生物体的先天免疫和炎症反应具有至关重要的作用[22]。AMPs 最广为人知的特性是其潜在的抗菌性。近几十年来，AMPs 作为抗生素的替代品（特别是在治疗耐药菌株所致感染方面）被广泛研究[23]。AMPs的种类繁多，这与其在宿主体内具有多种多样的抗菌活性有关[24]。各种生物体中AMPs的共同特征是：1）AMPs的分子量相对较小，最多包含100 个氨基酸。2）由精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸残基的存在决定了AMPs 带有正电荷。由于AMPs 带有正电荷，故也被称为阳离子AMPs。3）AMPs 具有亲水脂结构的能力，其特征是存在疏水和亲水的结构域。AMPs的分类标准包括：1）按照生物合成的途径，AMPs 可分为核糖体合成AMPs和非核糖体合成AMPs。2）按照来源，AMPs 可分为昆虫AMPs、哺乳动物AMPs、两栖动物AMPs、植物AMPs、细菌AMPs 及鱼类、软体动物、甲壳类来源的AMPs 六类。3）AMPs 最常见的分类方法是基于其二级结构的分类[25]。按照二级结构，AMPs可分为四组：⑴线性AMPs。⑵α-螺旋结构（蛙皮素，LL-37）肽。⑶β-折叠肽。⑷线状肽。线状肽具有扩展结构，是以一种或多种氨基酸(富含色氨酸和脯氨酸/精氨酸残基的吲哚烷和牛AMPs-5)和环状结构肽为主的AMPs。线状肽中包括羊毛硫抗生素(主要是尼生素)。羊毛硫抗生素是丝氨酸、苏氨酸残基侧链经翻译后脱水，与半胱氨酸反应形成非典型氨基酸羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸，再与硫醚桥接形成的环状肽。另外，具有环状结构的肽也可以是由一个二硫化物桥 (如乳铁蛋白肽B和牛AMPs-1 等)形成的。有研究表明，AMPs 二级结构的生物活性与其对细胞膜的影响密切相关。4）AMPs 还可按照优势氨基酸的残基进行分类。有研究表明，许多细菌AMPs的抗菌机制是对细胞膜进行降解，这与蛋白质和磷脂的负电荷官能团的静电吸引有关[26]。但是，有证据表明，AMPs 对某些细胞合成的进程有抑制作用，如核酸和蛋白质的合成、酶活性和细胞壁合成[27]。考虑到AMPs的抗菌作用机制，细菌对AMPs 产生耐药性较为困难，这与细菌细胞需要在磷脂膜的组成和/或结构中发生剧烈的改变有关[28-29]。部分研究人员发现，微生物体能够显示出对AMPs产生耐药性的能力，如蛋白的水解降解机制、由细菌捕获或排出AMPs 及微生物负表面电荷的部分减少等[30-32]。另外，也有其他促进致病菌对AMPs 产生耐药性的机制，如形成生物膜保护的致病菌、或改变革兰阴性菌外膜流动性导致其渗透性降低等机制[33-34]。

2 噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs 在生物医学领域中的应用情况

致病菌对抗生素抵抗的问题目前已成为主要的临床问题，需积极寻找抗生素疗法以外治疗致病菌所致感染性疾病的新策略。因此，对噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs 在生物医学领域中的应用情况做如下介绍。

2.1 噬菌体显示技术的应用情况

近年来，随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学等技术的引进和发展，我国对各种新药的研发均取得了很大的进展。1985 年史密斯等引入的噬菌体显示技术，在药物科学中发挥了重要的作用。噬菌体显示技术是指利用基因工程手段通过产生噬菌体群体(噬菌体文库)，使工程噬菌体的表面产生随机序列的多肽、蛋白或抗体的一种显示技术。从一个大的种群中，噬菌体能够选择性地结合到目标宿主病毒(生物合成)，而随机引入的噬菌体基因组cDNA 序列被表达后形成融合肽，并将其连接到构建噬菌体外壳的表面蛋白上，融合肽会显示在病毒体之外，而引入的DNA 则会留在噬菌体的颗粒内。噬菌体显示技术是研发新药的一种有效工具，其主要作用是识别具有新功能的配体，而噬菌体文库的开发则是发现抗菌治疗新组分的重要研究进展。目前，采用噬菌体显示技术已筛选出了结构和功能齐全的酶，并分离出一系列能与给定因子特异性结合的多肽。这些分离肽在体外试验中均被证明是有效的酶功能抑制剂，可用于评估酶的活性或研发将其作为组成部分的多肽药物。有研究表明，使用噬菌体显示技术获得的肽，能够抑制细菌细胞内靶蛋白的功能。相关的试验结果证实，在选择了严格调控启动子的控制下，以s-谷胱甘肽转移酶融合的方式表达具有已知功能关键靶点的肽段，宿主细菌细胞内特异性靶蛋白的失活可抑制细菌的生长。

2.2 噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs 联合应用的可能性

有研究表明，单一使用噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs的抗菌作用存在部分受限的缺点，而共同应用噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs 进行抗菌处理时可起到协同效应。这是因为，将噬菌体编码的AMPs 作为一组特定的AMPs 形式应用，可消除将噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs 作为单一特异性抗菌药所造成的许多限制。有研究人员对联合应用尼生素和两种裂解噬菌体抑制金黄色葡萄球菌活性的效果进行了研究，结果显示，在巴氏杀菌牛奶中确实可观察到噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs 杀灭病原菌的协同效果，但其中的耐尼生素细菌会对噬菌体的活性产生负面影响。这与细菌表面发生的炎症反应可能使其对尼生素产生耐药变化，从而干扰了噬菌体受体的结合或识别等因素有关。耐尼生素菌株的疏水性较差，且带有较高的正电荷，这与其缺乏细胞色素c 与尼生素的结合表达有关。耐尼生素菌株对尼生素失去抵抗力后，可恢复对噬菌体的敏感性。这是由于其对噬菌体不敏感的突变体对尼生素没有耐药性所致。上述研究的结果表明，将尼生素与乳制品中发现的金黄色葡萄球菌噬菌体联合应用的可能性有限。有研究小组将由鲍氏不动杆菌噬菌体ФAB2编码的细胞内溶素LysAB2的C 端两亲性螺旋区合成了4 个腺嘌呤的核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP），这些多肽多核苷酸均表现出对鲍曼不动杆菌很强的抗菌活性 (MIC 4-64μM)。这些鲍曼不动杆菌中包括一些多重耐药的鲍曼不动杆菌和耐多粘菌素的鲍曼不动杆菌。在四种AMP中，LysAB2 P3 经修饰后其净荷增加，疏水性降低，对鲍曼氏杆菌有较高的抗菌活性，但对正常真核细胞的溶血活性较低，无细胞毒活性。有研究人员对AMPs 进行了电镜和荧光素异硫氰酸酯染色实验，结果显示LysAB2 P3 能够通过细胞膜的渗透作用杀死鲍曼原虫。另外，在进行小鼠腹腔感染模型实验的过程中，为小鼠注射鲍氏不动杆菌噬菌体ФAB2 编码的细胞内溶素LysAB2的4 个小时后，LysAB2 P3 可使其腹腔液体中细菌的数量减少13 倍，使其血液中细菌的数量减少27 倍，而且LysAB2 P3 还可使约60%严重感染鲍曼氏杆菌的小鼠免于发生致命性菌血症[35]。上述研究的结果表明，噬菌体内溶素是一种很有发展前景的有效AMP。噬菌体编码的AMPs 是一类特殊的抗感染药物，除了能够使真核生物与细菌产生AMPs，还可形成一类被命名为噬菌体编码的AMPs化合物。噬菌体编码的AMPs 包括两种类型：1）噬菌体编码的裂解因子和噬菌体尾部复合物。这些复合物来自小基因组构成的单链DNA 或RNA的噬菌体，类似于大型裂解噬菌体内溶素-穴蛋白系统的组成。2）噬菌体编码的AMP 噬菌体尾部复合物。这些复合物是肽亚基的大分子聚合物，其负责识别和结合具体的表面受体,通过致病菌细胞外膜的渗透与原位裂解细胞壁的肽聚糖位点相结合,再介导噬菌体的基因组进入致病菌的细胞内。这说明，将噬菌体尾部复合物作为替代抗菌剂的可能性似乎是真实存在的，特别是对革兰阴性菌可通过穿透细胞外膜的机制开始发挥作用。有研究人员从一个大的10-mer 噬菌体肽库中，选择了与整个大肠杆菌细胞结合的AMPs，其中一种多肽以单体和树突状两种形式被分离合成，而且树突状多肽的抗菌活性远远高于单体形式多肽的抗菌活性。另外，该研究人员还通过氨基酸的残基取代或链缩短的形式对AMPs的原序列进行了修饰，结果显示这三种不同的AMPs 比自然降解的AMPs 具有更强的抵抗力，其对大量的革兰阴性菌具有更强的杀菌活性，对血液蛋白酶具有更高的耐药性，溶血的活性较低，对真核细胞的细胞毒性较弱，有望成为新的抗菌药。

3 小结

本文探讨了近年来对噬菌体、噬菌体内溶素和AMPs在生物医学领域中的研究进展，认为这三种药物可能会构成一种新型的抗菌药。这种新型的抗菌药有助于对抗感染，包括由MDR 菌株引起的细菌感染。与传统的抗生素相比，这种新型的抗菌药具有显著的优势，这是因为溶原噬菌体能够用于广泛地表达具有生物活性的多肽，可将其作为抗菌药、抗原或抗癌药的载体。但是，目前有关AMPs 与溶菌噬菌体的直接相互作用、AMPs 对临床相关病原体溶解酶的研究有限，需在今后的研究中对此进行更广泛的研究，以便为解决致病菌对抗生素抵抗的问题提供参考。