主动脉瓣膜间质细胞分化机制研究进展

由万宁，赖永洁

现今心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）已成为全世界最主要的死亡原因［1］，其中瓣膜性心脏病（valve heart diseases，VHD）是CVD 的重要类型之一。随着社会老龄化加剧，VHD 患病率逐年升高。据统计，美国75岁以上老年人中VHD的患病率为11.7%～13.3%［2］。我国成年人口中VHD的患病率为5.3%～7.7%［3］。VHD的两大病理表现为瓣膜的纤维化与钙化，而瓣膜内部细胞行为的改变是瓣膜发生病理改变的重要基础［4-5］。瓣膜内部主要由瓣膜内皮细胞、瓣膜间质细胞（valve interstitial cells，VICs）和VICs 分泌的胶原蛋白、弹性纤维、蛋白多糖、纤连蛋白（Fibronectin，FN）等多种细胞外基质（extracellular matrix，ECM）共同构成［6-7］。VICs 的数量约占瓣膜中细胞总数的80%，VICs与ECM对维持心脏瓣膜的正常结构与功能至关重要，VICs 具有向多种表型分化的潜能，其中肌成纤维细胞表型分化是瓣膜产生纤维化病理改变的关键环节，也是进一步促使瓣膜钙化的因素之一，而成骨细胞表型分化则与瓣膜钙化密切相关［8］。近年来对VICs分化的研究为揭示VHD的发生机制提供了重要的理论依据，现就有关VICs分化的最新研究进展作一综述。

1 VICs的肌成纤维样表型分化

正 常 VICs 表 现 为“ 静 止 ”（quiescent VICs，qVICs）状态，即成纤维细胞样表型，但在损伤、某些细胞因子、异常血流或机械应力等刺激下会被激活转变为活化（activated VICs，aVICs）表型，即肌成纤维细胞样表型［9］。aVICs 表现为细胞收缩性能增强以及细胞骨架成分，如α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、结蛋白、波形蛋白等蛋白标志物以及基质分解代谢酶和弹性蛋白酶的表达增加。正常状态下，aVICs在完成组织修复后将转入静止期恢复成为qVICs，或者发生凋亡以维持组织平衡稳态［10］。相比qVICs，aVICs在ECM中产生胶原蛋白，特别是Ⅰ、Ⅲ型胶原的能力更强［11］。若VICs 的活化因素持续存在则可进一步导致瓣膜纤维化或钙化的发生。

1.1 细胞因子的作用 目前研究普遍认为转化生长因子-β1（TGF-β1）是主导qVICs活化的重要细胞因子之一，在炎症或损伤等因素刺激下，迁移至瓣膜中的多种免疫细胞以及VICs 均可分泌TGF-β1，与细胞表面受体结合后通过经典SMAD通路或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38 非经典通路等促进qVICs 向 aVICs 表型转变，表现为 α-SMA 表达增加，同时Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，结缔组织生长因子等水平上调，促使瓣膜ECM 发生重构，从而引发瓣膜进一步的纤维化［12］或钙化［13］。

Adesanya 等［14］研究发现细胞膜修复蛋白MG53（mitsugumin53）在VICs中有表达，MG53基因敲除小鼠更易于发生类似主动脉狭窄的病理改变，体外实验证实，在VICs培养体系中加入MG53后，可显著下调TGF-β1 所诱导的SMAD 同源物2（SMAD2）磷酸化水平，同时降低下游，如FN等靶基因的表达水平，对VICs 的活化过程产生有效抑制，推测MG53 可能通过参与VICs细胞膜修复，降低损伤对细胞产生的刺激，从而减少TGF-β1 信号通路的激活并抑制VICs 的活化。此研究虽未阐明具体的调控机制，但MG53 在VHD 进程中的保护作用为VHD 的治疗提供了新的药物靶点。

白细胞介素（IL）-18 为IL-1 超家族成员，是重要的炎性细胞因子。有研究发现IL-18在主动脉钙化患者血清以及钙化瓣膜内部水平均显著升高，体外实验表明IL-18 通过激活核因子（nuclear factor，NF）-κB 通路上调高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）水 平 进 而 促 进 VICs 活化［15-16］。但是，HMGB1如何参与调控VICs活化并不清楚，同时 VICs 是否分泌 IL-18，IL-18 促 VICs 活化与瓣膜钙化之间的关联也值得进一步探讨。

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-2被认为是健康瓣膜组织中维持VICs处于静止状态的关键细胞因子［17］。在瓣膜组织损伤修复过程中，FGF-2可抑制由TGF-β1所诱导的VICs活化，避免过量ECM 沉积，帮助及时终止修复，避免瘢痕产生，其与TGF-β1 之间的平衡对VICs 活化状态以及瓣膜组织重构具有重要意义。此外，FGF-2 还可促使已活化的aVICs 发生去分化，恢复为静止的qVICs，从瓣膜中分离得到的VICs 在体外培养时往往发生不同程度的自发活化，这对研究VICs的分化机制产生不利影响。若在VICs 原代培养体系中加入外源性的FGF-2，可将VICs 维持在低活化水平，则有助于相关细胞功能实验的进行［18］。同时FGF-2对VICs 活化的抑制作用也为VHD 的干预与治疗提供了新思路。

1.2 金属蛋白酶的作用 去整合素样金属蛋白酶（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族是一类以多种ECM为降解底物的蛋白酶，通过ECM重构参与组织器官正常发育过程，同时其表达异常也与众多疾病发生密切相关。近年来有关心血管疾病的研究发现，ADAMTS成员在瓣膜发育与疾病中的新作用［19］。ADAMTS-5 是重要的蛋白聚糖降解酶之一，在骨关节系统炎症等疾病中常可见其水平上升。而在ADAMTS-5基因敲除的动物模型中发现，ADAMTS-5基因缺失可导致二叶主动脉瓣或二叶肺动脉瓣的先天发育异常［20］，提示了ADAMTS-5在维持瓣膜正常结构与功能中的作用。Li 等［21］研究发现ADAMTS-5 缺失促进了瓣膜钙化的发生，体外细胞实验则证实ADAMTS-5 缺失导致VICs 中matrilin2水平上调，matrillin2 是协助构建ECM 网络重要的辅助蛋白，其水平升高促使与VICs 活化相关的蛋白表达水平上调，重组ADAMTS-5 蛋白处理VICs后matrilin2 蛋白水平下调并伴随VICs 活化相关蛋白表达显著下调，因此ADAMTS-5/matrilin2 轴参与了VICs 活化调控。针对两者的靶向调节可能成为VHD 早期干预的策略之一。该项研究还发现，matrilin2 诱导 VICs 活化的同时，VICs 开始表达如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、runt相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）等成骨细胞分子标志物，提示VICs 活化与成骨细胞分化并非2 个孤立的分化路径，但两者的内在联系还需进一步深入探讨。

ADAMTS-19 是新近发现的ADAMTS 家族成员，其酶解底物不明，近期研究表明部分常染色体隐性遗传心脏瓣膜病患者存在ADAMTS-19 基因功 能 的 缺 失 性 突 变［22-23］。 Wünnemann 等［22］对ADAMTS-19 基因敲除小鼠的研究证实，ADAMTS-19 功能缺失可导致瓣膜发育异常并出现进行性的主动脉瓣狭窄或反流；进一步分析表明，ADAMTS-19 是新型 VICs 标记分子，ADAMTS-19 基因敲除小鼠VICs 的活化相关蛋白α-SMA 水平下降，说明ADMTS-19 缺失抑制了VICs 活化。通过单细胞RNA 测序及转录组分析筛选出淋巴增强因子-1（lymphoid enhancer-binding factor 1，Lef1）参 与ADAMTS-19 的转录调控，Lef1 是 Wnt/β-catenin 信号通路的重要下游分子之一，随后的VICs 体外培养实验证实 ADAMTS-19 是 Wnt/β-catenin 通路的应答基因；但并不清楚此通路对ADAMTS-19 的调控是否参与了 VICs 活化。Chen 等［24］研究表明TGF-β1 可通过激活 β-catenin 诱导 VICs 活化，Wnt/β-catenin 通路与 TGF-β1 之间的协同效应可加强VICs 活化，据此推测Wnt 信号通路被抑制可能是ADAMTS-19 缺失导致VICs 活化减弱的机制之一，而进一步揭示该机制则需要对VICs 活化过程中Wnt/β-catenin 通路的激活水平进行深入研究。

1.3 力学因素作用 瓣膜对血流动力学以及机械应力的改变具有高敏感性，由VICs 活化所引发的ECM纤维化或钙化可提高ECM硬度，进而上调VICs所承受的剪切应力，此过程可显著诱导局部TGF-β1水平上调，进一步增强了VICs 的活化，参与VICs 应力感受的蛋白对其活化发挥重要作用［25］。Calponin2蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，能够调节平滑肌收缩，参与细胞压力信号传导［26］。Plazyo等［27］发现Calponin2上调可增强VICs的活化指标α-SMA 的表达水平，Calponin2 可能通过与 α-SMA 的结合增强VICs 的收缩功能，促进VICs 的活化，提示Calponin2 上调与VICs 活化之间形成的正反馈通路可能是瓣膜进一步产生纤维化与钙化的机制之一。

钙黏蛋白（cadherin，CDH）家族是一类依赖钙离子介导细胞间黏附的跨膜糖蛋白，其中CDH11是唯一可介导黏着斑形成的钙黏蛋白，通过机械信号的传递参与细胞迁移、创伤愈合等生理过程，在瓣膜纤维化、钙化等病变中均可见其水平显著上调［28］。Wang 等［29］研究发现 TGF-β1 处理可显著上调VICs的 CDH11 表达水平，提示 CDH11 是 TGF-β1 的下游基因，将VICs 中的CDH11 基因敲低处理后α-SMA表达增加，VICs 活化水平提高；而增强CDH11 活性则显著抑制VICs 活化，表明CDH11 在VICs 活化过程中可能发挥抑制作用，TGF-β1 在诱导VICs 活化时，不仅上调正向调控活化的靶基因，还促进负向调控活化靶基因的表达，这可能是细胞维持平衡稳态的机制之一。Bowler 等［30］对 CDH11 基因敲除小鼠的分析证实，CDH11 缺失可上调α-SMA 水平，CDH11 对 VICs 活化存在负向调控，但 CDH11 亦可通过促进黏着斑形成以及上调IL-6通路增强VICs-ECM间的机械信号传导，一定程度上对VICs活化起到促进作用，以上提示CDH11在VICs活化中的双重功能，同时其在瓣膜疾病中的作用还需从多角度进行深入探讨。

Ma等［31］利用人工合成水凝胶进行VICs的3D培养时发现，培养基基质硬度增加可显著诱导VICs活化 ，此 时 VICs 中 Yes 相 关 蛋 白（Yes-associated protein，YAP）发生核转位，YAP 作为转录协同因子可激活下游基因如α-SMA 表达。此研究中VICs 对周围压力上升的感知直接导致YAP 向核内转移，而压力下降则可见YAP 核内转移被抑制。进一步分析发现，细胞黏着斑面积与YAP核转移及VICs活化水平均呈正相关，证实黏着斑作为细胞与ECM间的连接点，是介导压力信号传导的关键结构。VICs 对压力感应的调控成为VICs 活化机制又一值得关注的研究方向。

2 VICs的成骨表型分化

VICs 向成骨细胞表型分化可促进多种促钙化因子上调，导致异位钙化，在钙化的早期阶段，炎症或者机械应力刺激VICs 可激活骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 以及 Runx2 等与成骨细胞密切相关的重要信号分子，细胞开始表达ALP、骨钙素等成骨细胞分子标志，VICs向成骨细胞表型分化，进一步导致瓣膜增厚变硬，最终发生钙化［32］。

2.1 成骨分化相关信号通路

2.1.1 Wnt 通路 Wnt 信号通路广泛参与人体生长发育和病理过程，是VICs成骨表型分化的重要调控因子［33］。Li 等［34］利用成骨诱导培养基培养 VICs 时发现细胞成骨标志物Runx2 表达增加，同时糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β 与 βcatenin 表达水平明显上调，而在培养体系中加入Ⅰ类组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂 MS-275 后，Runx2、GSK-3β 与 β-catenin 水平均显著下降，且细胞内钙质沉积明显减少，表明Wnt/GSK-3β 和 Wnt/β-catenin 两条通路被抑制可下调Runx2 的表达，进而抑制VICs 的成骨分化。Polley等［35］发现使用成骨诱导培养基培养VICs后，细胞中内源性无孢蛋白（asporin）表达水平降低，而将asporin重组蛋白加入培养体系后显示成骨细胞分子标志骨桥蛋白和Runx2表达均减少，同时β-catenin、Wnt3a 水平下调，而Wnt3a 重组蛋白处理VICs 后细胞的成骨分子标志表达增加，在此基础上再加入asporin 重组蛋白，细胞的成骨分化则被显著抑制。因此，asporin作为瓣膜中的ECM成分可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活阻止VICs向成骨分化，证实Wnt通路激活对成骨分化的促进作用。以上研究未就相关蛋白如何抑制Wnt通路激活进行深入探讨，但仍充分说明Wnt通路在驱动VICs 成骨分化中的关键作用，对此通路的研究对充分阐明VICs成骨分化机制十分重要。

2.1.2 MAPK/ERK 通路 细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）为MAPK激活后的下游信号分子之一，在细胞生长分化调控中具有重要作用。 蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）为丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，参与调控真核细胞内多种信号通路，在主动脉瓣膜钙化模型小鼠以及成骨诱导培养的VICs中PP2A水平及活性显著下降，VICs 中过表达PP2A 可见MAPK/ERK 通路被抑制，细胞成骨分化水平降低，而敲低PP2A后MAPK/ERK通路激活，细胞成骨分化水平升高，再次证实MAPK/ERK通路可能参与促进VICs成骨表型分化［36］。最近一项有关主动脉瓣膜钙化疾病（aortic valve calcification disease，CAVD）的研究［37］发现，CAVD 患者血清中锌离子水平较正常人明显降低，体外细胞实验表明在磷酸盐诱导的VICs成骨分化模型中添加硫酸锌可降低成骨相关基因的表达，并且还可通过抑制VICs 凋亡阻碍VICs 成骨分化。胞外锌离子可通过结合胞膜上锌敏感受体G蛋白偶联受体39（G protein-coupled receptors，GPR39）激活MAPK/ERK 通路，抑制VICs 凋亡和成骨分化，研究者认为通过补充锌离子可对CAVD 起到保护作用，但此研究还发现MAPK/ERK 对VICs 成骨分化发挥抑制作用。关于MAPK/ERK 信号通路在VICs 成骨分化中的作用，上述两项研究的结果并不一致，这可能是不同研究中使用的成骨诱导分化培养基的成分不一导致细胞外环境存在差异，或是细胞种属来源不同等因素导致。

2.1.3 Notch通路 Notch1是Notch细胞表面受体家族成员之一，通过与相应配体结合激活下游通路，在胚胎早期发育、细胞分化等方面具有重要生物学作用。近年研究发现其参与了VICs成骨分化进程，但其具体作用仍存在争议。Majumdar 等［38］发现一氧化氮可通过上调泛素特异性蛋白酶9X（X-linked ubiquitin-specific protease 9，USP9X）的巯基-亚硝基化水平促进后者对下游Notch1 通路的激活作用，以此抑制主动脉瓣VICs的成骨分化过程，此研究认为激活Notch 通路对VICs 成骨分化有抑制作用，对此通路的调控机制研究可为CAVD的治疗提供新的理论参考。Zeng等［39］研究结果显示CAVD患者瓣膜钙化区域中Notch1表达阳性的VICs数量较多，脂多糖处理VICs 后成骨分化指标明显上升，Notch 通路被激活，Notch1表达量增加，而将Notch通路抑制后，脂多糖诱导VICs 成骨分化的水平则明显减弱。此研究认为，Notch1 还参与激活 ERK1/2 与 NF-κB 两条信号途径以此促进VICs 成骨分化，表明除Notch 通路本身被激活之外，与其他信号通路之间的交互作用也是促进VICs 成骨分化的机制之一。此外，Perpelina 等［40］研究也认为 Notch1 通路激活可驱动VICs的成骨分化。与MAPK/ERK 通路类似，不同的研究对Notch通路在VICs成骨分化中的作用也存在不同看法，鉴于VICs 分化与周围环境的密切关系，如能建立最大程度还原人体内微环境的VICs 体外培养体系可能是解决上述争议的方法之一。

2.2 微小RNAs（miRNAs）与表观遗传调控 miRNA是一类可在转录水平上对靶基因进行调控的新型调控因子，目前利用miRNA谱技术对钙化与非钙化瓣膜的miRNA差异谱进行分析，已筛选出多种可能参与VICs 成骨分化调控的miRNA。miR-29b 在钙化瓣膜中表达增加，降低其水平可减弱VICs的成骨分化。TGF-β3是miR-29b的直接靶标，miR-29b抑制TGF-β3 的同时 Wnt3/β-catenin 与 Runx2/Smad3 通路被激活继而导致VICs 成骨分化，但TGF-β3 下调与促成骨分化信号通路激活之间的内在联系仍需进一步研究［41］。miR-138 水平在钙化瓣膜中显著降低，将其模拟物作用于VICs中后，Runx2和ALP显著下调，而将miR-138 抑制剂转染细胞则增加Runx2与ALP 表达水平。miR-138 对VICs 成骨分化可能发挥抑制作用，通过靶点预测以及RNA和蛋白水平实验证实转录因子叉头框蛋白C1（forkhead box protein C1，FOXC1）是miR-138 的靶点，FOXC1 过表达促进VICs 成骨分化，敲低FOXC1 则抑制成骨分化，说明miR-138通过下调FOXC1抑制VICs成骨分化，但此过程中FOXC1通过哪些下游蛋白来发挥其促成骨作用尚不清楚［42］。Toshima 等［43］认为 miR-34a水平在钙化瓣膜中上调，miR-34a通过下调靶基因Notch1 并抑制后者下游通路激活来促进VICs 成骨分化。另一组研究发现，miR-204 在钙化瓣膜中表达极低，采用类似物上调VICs 中miR-204水平可降低 ALP 与 Runx2 的表达，而抑制 miR-204 则促进成骨标志物的表达，表明miR-204 的存在可负向调控VICs 成骨分化［44］，但此研究并未确定其靶基因，对其调控机制的解释仍需补充。miRNAs在VICs成骨分化中的功能因其靶点差异而有所不同，揭示靶基因与成骨分化通路之间的关联机制有助于全面准确认识miRNAs的作用，为进一步防治CAVD提供新的线索。

此外，长链非编码RNA（lncRNA）也参与VICs分化调控，肺腺癌转移相关转录子1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1）是一种在心血管系统中高表达的lncRNA，参与多种心血管疾病发生［45］。MALAT1在钙化瓣膜以及VICs成骨分化模型中表达水平升高，体内实验证明MALAT1通过与miR-204的吸附作用抑制后者活性；Smad4 为 miR-204 的靶基因，Smad4 被抑制则阻碍VICs的成骨分化，MALAT1通过负向调控miR-204 来促进Smad4 所介导的成骨分化，MALAT1、miR-204及其靶基因Smad4之间构成的纵向调节轴可能是调控VICs 成骨分化的机制之一［46］。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA 1（actin filamentassociated protein 1-antisense RNA 1，AFAP1-AS1）是另一种在钙化瓣膜中存在高表达的lncRNA，它通过调节miR-155/Smad5 轴，增加Smad5 的表达来促进VICs向成骨表型分化［47］。此外，OPA相互作用蛋白5-反义RNA 1（OPA interacting protein 5-antisense RNA 1，OIP5-AS1）作为 lncRNA，与 miR-137 的结合可导致下游蛋白Twist1 水平升高，从而阻碍VICs成骨分化［48］。由此可见，lncRNAs通过类似“分子海绵”的作用吸附miRNAs 后解除后者对其下游靶基因的抑制作用，增强靶基因的表达水平，而靶基因的具体功能将决定lncRNA 作为上游调控分子对VICs成骨分化产生何种影响。lncRNA、miRNA及其下游靶基因三者之间的调控机制为VICs 成骨分化、CAVD的防治开辟了一个新的研究方向。

DNA 甲基化能够通过抑制相应基因转录实现对基因的表达调控，是一种重要的表观遗传调控方式［49］。Zhou 等［50］在钙化瓣膜与 VICs 成骨诱导分化模型中发现Notch1蛋白水平降低，同时Notch1启动子区甲基化水平较高，甲基转移酶抑制剂处理VICs后 Notch1 细 胞 间 结 构 域（Notch1 intercellular domain，NICD）水平上调，β-catenin 通路被抑制，细胞成骨分化趋势减弱，Notch1 启动子甲基化则导致Wnt/β-catenin 途径活化和成骨分化加剧，以上表明Notch 通路可能通过负向调控Wnt/β-catenin 激活发挥抑制VICs成骨分化的作用。此外，lncRNA H19在钙化瓣膜中呈高表达，其启动子区呈现低甲基化水平，将H19 作用于VICs 成骨分化模型中，显示过表达H19 促进细胞成骨分化，而敲低H19 则抑制成骨分化；进一步分析表明，H19过表达可直接导致转录因子p53蛋白水平降低，而p53作为Notch1表达的正向调控因子，其水平降低导致Notch1 表达减少，Notch通路被抑制，从而促进VICs成骨表型分化［51］。Vander Roest等［52］发现老龄（78周龄）C57BL6小鼠的主动脉瓣膜出现早期钙化表现，但随后的甲基化水平检测并未发现其主动脉H19的甲基化水平与幼龄（26周龄）小鼠之间存在显著差异，表明H19甲基化水平改变可能并非促成瓣膜钙化的始动因素，其变化可能受其他因素调控。以上研究说明VICs 成骨分化通路中的成员，尤其是位于通路上游的关键信号分子对调节VICs成骨分化具有重要作用，这些关键分子DNA 的异常甲基化水平对下游分子表达产生不同影响，因此表观遗传学调控也是VICs成骨分化研究中又一值得关注的领域。

综上所述，VICs 向肌成纤维样细胞或者成骨样细胞分化过程受多种因素调控，而2 种分化过程在CVD 患者病变瓣膜中往往共存，提示两者之间存在内在关联，针对分化机制的研究还需将两者加以联系。目前，已有大量有关VICs 分化机制的研究为CVD 的防治提供了多方向的策略与药物设计靶点，但VICs体外实验存在局限性，结合动物疾病模型以及体内实验研究可能有助于VICs分化机制的完善。另外，关于脱离瓣膜微环境后的人工培养VICs，如何全面准确地再现其在体内的分化过程对今后的研究也是一个挑战。