大麻二酚通过激活PPAR-γ减轻四氯化碳所致小鼠急性肝损伤

舒远辉，马润，谢娜，李垚，王豫萍，2△

肝损伤是一个多因素、多途径、多靶点共同作用的结果［1-2］。短时间内肝脏受到药物、病毒、化学毒物大量刺激会引起急性肝损伤［3-4］。肝损伤可进一步发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌等严重的肝脏疾病。因此，如何有效地预防和治疗肝损伤，已经成为国内外研究的焦点。大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻（Cannabis Sativa）中含量最多的非成瘾成分，患者即使长期使用仍具有良好的安全性［5-6］。研究证明，CBD对急性、慢性炎症动物模型有治疗效果［7-8］。CBD对氧化应激和炎症相关的疾病如结肠炎［9］、糖尿病并发症［10］、药物诱导的肾毒性［11］、乙醇诱导的脂肪沉积症或缺氧缺血引起的脑损伤等［12］具有治疗作用。本课题组前期研究结果发现，在慢性过量乙醇饲养的小鼠酒精性肝损伤模型中，CBD可通过减轻氧化应激反应和炎症反应改善酒精性脂肪肝［13］。然而，CBD对化学毒物所致肝损伤是否也有保护作用目前尚未明确。本研究使用四氯化碳（CCl4）诱导小鼠急性肝损伤，探讨CBD对小鼠急性肝损伤的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物42只雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，6～8周龄，体质量（22±2）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，批准号：［SCXK（京）2016-0002］，小鼠饲养于通风良好，温度（22±2）℃，湿度40%～70%，昼夜节律（12 h/12 h）相对恒定的环境中，自由饮食饮水，适应性饲养1周后开始建模。

1.2 主要试剂与仪器CBD、还原型谷胱甘肽（GSH）购自美国Sigma公司，CCl4购自中国Aladdin公司，超氧化物歧化酶（SOD）、GSH、丙二醛（MDA）检测试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所，抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自英国Abcam公司，抗过氧化物增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）抗体、抗环氧合酶-2（COX-2）抗体购自中国万类生物科技公司，全蛋白提取及BCA定量试剂盒购自中国北京索莱宝公司。ELX酶标仪、全套电泳装置购自美国Bio-Rad公司，超高速低温离心机购自美国Beckman公司，化学发光成像仪购自上海培清有限公司。

1.3 动物分组和建模方法 将42只C57BL/6J雄性小鼠采用随机数字表法分为5组：对照组（9只）、模型组（9只）、CBD对照组（9只）、GSH干预组（阳性对照组，6只）、CBD干预组（9只），其中CBD对照组、GSH干预组、CBD干预组分别腹腔注射CBD 5 mg/kg、GSH 200 mg/kg、CBD 5 mg/kg，对照组、模型组注射相同剂量的生理盐水。2 h后模型组、GSH干预组、CBD干预组腹腔注射含20%CCl4橄榄油5 mL/kg建立急性肝损伤模型，对照组、CBD对照组注射相同剂量的橄榄油。禁食12 h，不禁水，造模24 h后麻醉小鼠，摘眼球取血，后颈椎脱臼处死小鼠，立刻冰上留取肝左叶，置于-80℃低温冰箱保存备用；同时肝右叶以4%多聚甲醛固定，并在3 d内石蜡包埋、切片，准备组织病理检测。

1.4 指标检测与方法

1.4.1 肝组织HE染色检测病理变化 将肝组织用4%多聚甲醛固定24 h后脱水处理，再行石蜡包埋，用切片机切取约4 μm厚的组织贴片，进行HE染色，光镜下（×200）观察肝组织的形态病理变化及损伤程度。

1.4.2 血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）检测 将收集到的小鼠血液室温静置，至血块自然收缩有血清析出，3 500 r/min离心10 min，收集上层血清，采用罗氏生化仪COBAS C501，按标准操作肌酸激酶测定（IFCC）法检测血清ALT、比色法检测血清AST。

1.4.3 肝组织匀浆检测SOD、GSH、MDA水平 每组随机抽取6只小鼠，取约100 mg肝组织，按照1∶9的比例加入生理盐水，用匀浆器充分研磨制成10%的肝组织匀浆。采用酶标仪，严格按说明书的操作步骤，水溶性四唑盐-1（WST-1）法检测SOD、微板法检测GSH、硫代巴比妥酸（TBA）法检测MDA。

1.4.4 Western blot法检测肝组织PPAR-γ、COX-2蛋白的表达 取约50 mg肝组织放入冰上预冷的研钵，加入液氮后快速研磨成粉末，再加入500 μL的RIPA裂解液和含1%蛋白酶抑制剂-苯甲基磺酰氟（PMSF），冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，上清液即所提蛋白。用BCA蛋白测定试剂盒按说明书测定蛋白浓度，加入相应体积的磷酸盐缓冲溶液（PBS）和5×上样缓冲液，使得各个样本体系蛋白浓度相同，煮沸10 min后置于-20℃保存备用。在20～40 μg之间，以相同的蛋白含量计算上样体积，进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，一抗（TBST稀释，GAPDH比例为1∶10 000，PPAR-γ为1∶1 000，COX-2为1∶1 000）4℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（TBST，1∶8 000稀释）室温孵育1 h，均匀滴加化学发光液（ECL）后在曝光仪上曝光，保存图片用Image J进行灰度分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 8.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较进行单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；非正态分布的计量资料以M（P25,P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CBD对小鼠模型肝脏病理变化的影响 见图1。HE染色显示，对照组、CBD对照组肝组织结构正常，细胞形态清晰，无明显异常，细胞间无炎性细胞浸润；模型组肝组织结构模糊，肝索解离，细胞出现大面积的脂肪变性，局部点灶状坏死；GSH干预组、CBD干预组肝组织结构较为清晰，仅有小面积细胞水肿及少量炎性细胞浸润。

Fig.1 Pathological changes in liver tissues of mice in five groups(HE staining,×200)图1各组小鼠肝组织病理变化情况（HE染色，×200）

2.2 CBD对小鼠血清ALT、AST的影响 与对照组比较，模型组、GSH干预组、CBD干预组ALT、AST水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，CBD对照组、GSH干预组、CBD干预组ALT、AST水平均降低（P＜0.05）；与CBD对照组比较，GSH干预组、CBD干预组ALT、AST水平明显升高（P＜0.05）；与GSH干预组比较，CBD干预组ALT水平无明显变化（P＞0.05），AST水平降低（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of serum ALT and LST levels between five groups of mice表1 5组小鼠血清ALT、AST水平比较 ［M（P25，P75）］

2.3 CBD对小鼠肝组织匀浆中SOD、GSH、MDA水平的影响 与对照组比较，模型组SOD、GSH水平明显降低，MDA水平明显升高（均P＜0.05）；与模型组比较，CBD对照组、GSH干预组、CBD干预组SOD、GSH水平明显升高，MDA水平明显降低（均P＜0.05）；与CBD对照组比较，GSH干预组MDA水平明显升高（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of SOD,GSH and MDA levels in liver tissue homogenates between five groups of mice表2 5组小鼠肝组织匀浆中SOD、GSH、MDA水平比较（n=6）

2.4 CBD对小鼠肝组织PPAR-γ、COX-2蛋白表达水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠肝组织PPAR-γ蛋白表达水平降低，COX-2蛋白表达水平升高（均P＜0.05）；与模型组比较，CBD对照组、GSH干预组、CBD干预组小鼠PPAR-γ蛋白表达水平升高，COX-2蛋白表达水平降低（均P＜0.05）；对照组、CBD对照组、GSH干预组与CBD干预组间差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2、表3。

Fig.2 Expressions of PPAR-γ and COX-2 proteins in liver tissues of mice detected by Western blot assay图2 Western blot法检测小鼠肝组织PPAR-γ、COX-2蛋白的表达

Tab.3 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ and COX-2 protein in liver tissues between five groups of mice表3 5组小鼠肝组织PPAR-γ、COX-2蛋白表达水平比较（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of relative expression levels of PPAR-γ and COX-2 protein in liver tissues between five groups of mice表3 5组小鼠肝组织PPAR-γ、COX-2蛋白表达水平比较（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别PPAR-γCOX-2对照组1.17±0.090.55±0.14模型组0.60±0.07a0.98±0.19a CBD对照组1.27±0.18b0.41±0.07b GSH干预组1.11±0.09b0.54±0.10b CBD干预组1.09±0.28b0.58±0.12b F 7.672＊＊8.320＊＊

3 讨论

肝脏是人体最大的器官，具有清除有害物质、毒素的重要功能，但也易受生物、化学毒素的攻击［14］。在关于肝损伤的研究中，CCl4诱导小鼠急性肝损伤是经典动物模型，其病理变化与人的肝脏病变有许多相似处［15］。AST和ALT是评估肝功能的敏感指标，正常状态下，ALT、AST主要存在于胞质内，很少出现在血清中。ALT活性升高提示肝细胞受损，细胞膜通透性增强；AST活性升高提示线粒体损伤［16］。本研究结果显示，模型组小鼠血清ALT、AST水平较对照组明显上升，结合病理结果，提示急性肝损伤模型建立成功；与模型组相比，GSH干预组、CBD干预组HE染色显示肝损伤程度明显减轻，血清ALT、AST水平降低，提示CBD对小鼠急性肝损伤具有一定的预防作用。

氧化应激反应在CCl4所诱导的肝损伤中起主要作用，在肝脏中，CCl4在细胞色素P450（CYP450）的作用下，刺激NADPH氧化酶产生大量的活性氧（ROS），突破GSH对ROS的防线，诱导自由基和脂质过氧化，减少抗氧化酶和抗氧化底物，导致氧化应激反应［17］。大量累积的自由基与DNA分子中的嘌呤、嘧啶和脱氧核糖骨架反应，破坏DNA结构，生成脂质过氧化产物MDA，大量MDA破坏肝细胞膜结构，造成肝细胞肿胀坏死，机体抗氧化酶SOD活性下降，引起肝脏损伤［18］。因此，通过检测组织中MDA、SOD、GSH水平可评价CCl4诱导的氧化损伤情况。本研究结果显示，CCl4可导致肝脏MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，而CBD可明显下调肝脏MDA水平，上调SOD、GSH水平，与Arbab等［19-20］的研究结果一致。因此，CBD对CCl4所致急性肝损伤的保护作用可能与提高肝组织抗氧化酶活性，减轻肝组织脂质过氧化反应，从而减轻氧化应激反应有关。

为了进一步了解CBD预防CCl4急性肝损伤的机制，本研究采用Western blot法检测了肝组织PPAR-γ、COX-2蛋白的表达。PPAR-γ是核激素受体超家族的成员，其参与细胞的分化、增殖、凋亡和细胞周期等相关生物过程的调控。COX-2是前列腺素生成的限速酶，其催化产生的前列腺素参与机体的炎症反应。有研究表明在相关肝病中PPAR-γ的活性受到抑制［21］，上调PPAR-γ能改善急性肺损伤中的炎症反应［22］。在脂肪性肝炎中，COX-2表达上调［23］。本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织PPAR-γ蛋白表达水平降低，COX-2蛋白表达水平升高；而CBD预处理明显逆转了上述趋势，提示CBD通过上调PPAR-γ的表达，进而发挥抗炎抗氧化的功能，在改善肝损伤的过程中可能发挥着重要的作用。

综上所述，CBD能通过降低小鼠ALT、AST、MDA水平，减轻炎症反应并提高小鼠的抗氧化能力，改善CCl4致小鼠急性肝损伤，其机制与激活PPAR-γ、降低COX-2的表达有关，但其具体通路仍待进一步研究。