RPL15在K562细胞向红系分化过程中的功能和机制研究

彭涛，周唯君，周栋珍，李化，兰金芝，李丹，周艳华，舒莉萍△

RPL15基因编码的核糖体蛋白L15（ribosomal protein L15，RPL15）属于真核生物核糖体60 S亚基的一个组成部分，蛋白分子质量约为24 ku。研究表明RPL15主要定位于核仁，这不仅利于核仁结构的形成与维持，还可能与核糖体RNA的成熟过程有关［1］。RPL15除了参与核糖体的组装与蛋白质的合成过程外，也与多种癌症的发生发展有关。既往研究表明，RPL15在结肠癌、食管癌及胃癌中表达量明显增高［2］，但在胰腺导管腺癌和皮肤鳞状细胞癌中表达量明显减少［3］。近期研究证实在先天性纯红细胞再生障碍性贫血（Diamond-Blackfan anemia,DBA）患者中RPL15基因存在突变［4］。本课题组前期研究发现，极光激酶抑制剂达努塞替（Danusertib，Danu）可通过极光激酶B/核糖体p70S6蛋白激酶/核糖体蛋白L15（Aurora B/p70S6K/RPL15）信号通路下调RPL15，引起K562细胞发生程序性死亡［5］。人红白血病K562细胞系作为研究细胞分化的模型，可在体外经诱导向红系分化，并且表达糖蛋白A和带3蛋白等红系特征性的蛋白［6］，提示RPL15作为Aurora B/p70S6K/RPL15信号通路轴中的关键下游分子，可能与红系造血细胞发育分化密切相关。目前，RPL15在红系造血发育过程中的生物学功能及具体作用机制尚未阐述清晰。因此本研究以红白血病K562细胞为实验对象，初步探究下调RPL15对K562细胞红系分化的影响，以期揭示RPL15在红系造血发育相关疾病中的功能和分子机制。

到杭州之后，李树化很快就出现了钢琴曲创作的一个高潮时期：当年就谱写了钢琴曲《湖上春梦》，1929年完成了钢琴曲《艺术运动》，1930年创作了钢琴曲《林间》。这一年的年底，他完成了献给妻子的钢琴曲《如此温柔》，表达了他对妻子的一往深情和感恩。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与质粒K562细胞系购自普诺赛生命科技有限公司，由本实验室传代并冻存。短发夹核糖核酸（shRNA）：RPL15-shRNA1、RPL15-shRNA2和NC-shRNA等3种pGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒均由上海吉玛制药技术有限公司构建。所用到的核苷酸序列见表1。

Tab.1 Target nucleotide sequence of plasmid表1质粒的靶位点核苷酸序列

1.2 试剂与仪器 胎牛血清、RPMI 1640基础培养液、青霉素和链霉素抗生素等细胞培养相关试剂均购自美国Gibco公司；氯化血红素（hemin）购自索莱宝生物科技有限公司；TRIzol购自Ambion公司；逆转录试剂盒（RevertAid™First Strand cDNA Synthesis Kit）购 自Thermo Fisher Scientific公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自天根生化科技有限公司；3,3',5,5'四甲基联苯胺（TMB）购自Sigma公司；兔抗人RPL15、β-actin单克隆抗体以及山羊抗兔二抗购自Abcam公司；CD71、CD235a流式抗体购自美国eBioscience公司；实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）引物购自Invitrogen公司。Celetrix电转仪购自达科为公司；CFX96 Real-Time PCR仪购自Bio-Rad公司；FC500流式细胞分析仪购自Beckman公司。

1.3 实验方法

1.3.1 K562细胞培养 用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液于5%CO2的孵箱37℃恒温培养。

2.3.1 精密度试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号：G-1）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以淫羊藿苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，22个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n＝6），表明本方法精密度良好。

柱状弹丸超高速碰撞薄板产生的碎片云和球形弹丸的结构有所不同，碎片云外形具有泡状结构。Piekutowski等基于柱状弹丸碎片云X射线图像，提出了描述柱状弹丸产生的泡状结构的碎片云模型[25-26]。Schonberg基于一维冲击波理论提出了改进的柱状弹丸碎片云模型[27]，该模型给出了柱状和类柱状弹丸碎片云各个特征速度的理论表达式，并且通过热力学分析，给出了碎片云中固、液、气三种相态下材料质量的计算方法。

结直肠癌患者血糖状态 根据空腹血糖状态检测结果统计，109例结直肠癌患者中血糖正常者(空腹血糖状态为3.9～6.1 mmol/L)为75例，占结直肠癌患者总数的68.80%；高血糖状态者(空腹血糖>6.1 mmol/L)为34例，占结直肠癌患者总数的31.19%；其中并发糖尿病者(空腹血糖≥7.0 mmol/L并经临床确诊)为18例，占结直肠癌患者总数的16.51%。

1.3.4 qPCR检测细胞RPL15和红系分化相关基因的表达RPL15基因表达检测：使用hemin诱导K562细胞向红系分化，分别设置0、24、48、72、96和120 h组。红系分化相关基因表达检测：电转染RPL15-shRNA2质粒的K562细胞采用hemin诱导培养72 h。收集对应组别细胞，用TRIzol提取总RNA，取1 μg RNA采用逆转录试剂盒合成cDNA。逆转录条件：42℃1 h，70℃5 min。通过qPCR试剂盒和CFX96 Real-Time PCR仪进行qPCR。扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共39个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达水平，实验重复3次。所用引物序列见表2。

中国传统青花瓷不仅在造型、装饰和表现手法上有特定的艺术价值，同时对现代青花的创作具有深远的影响。现代青花在装饰和表现手法上打破了传统的技法和观念，但是有些现代青花艺术一味追求自己精神上的表达，架空了现代生活的联系，应该更多地吸取传统的精神内涵，更有利于现代青花的发展道路。

Tab.2 qPCR primer sequence表2 qPCR引物序列

2.3RPL15对K562细胞红系分化过程中血红蛋白表达的影响 对照组0、24、48、72 h TMB染色阳性细胞比例分别为（3.15±0.28）%、（21.97±1.66）%、（36.62±1.00）%、（43.40±2.38）%，RPL15-shRNA2组4个时点染色阳性细胞比例分别为（1.77±0.81）%、（17.06±1.11）%、（27.40±2.86）%、（36.81±3.59）%。结果显示，与对照组相比，RPL15干扰后，24、48和72 h TMB染色阳性细胞比例明显下调（n=3，t分别为4.251、5.404、3.299，均P＜0.05），见图3A。各个时间点代表性TMB染色结果见图3B。

1.3.2 RNA干扰（RNAi）技术抑制K562细胞中RPL15基因的表达 培养K562细胞至对数期进行RNA干扰实验，取3×106个细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2次，加入20 μL电转液悬浮细胞，向细胞悬浮液中加入4 μg质粒，混匀并加入到20 μL体系电转杯内，用电转仪选择针对K562细胞的程序电转细胞，电击之后将细胞转移到预热的RPMI 1640完全培养基中，继续培养到指定时间进行RNA干扰效率检测及相关实验。

1.3.3 K562细胞红系分化诱导K562细胞于诱导前1 d更换新鲜的RPMI 1640完全培养基，并使其在诱导当天处于对数生长期。第2天加入40 μmol/L hemin，诱导K562细胞向红系分化。

2.1RPL15在K562细胞红系分化过程中的表达变化qPCR结果显示，RPL15的mRNA表达于诱导24～48 h逐渐升高，且在48 h表达水平达到高峰。而诱导72～120 h细胞内RPL15的表达水平却逐渐下降（n=3，F=30.938，P＜0.01），见图1A。同时，蛋白水平检测结果与mRNA水平一致（n=3，F=175.682，P＜0.01），进一步证实RPL15蛋白在K562细胞红系分化过程中表达呈先升高后下降的趋势，见图1B、C。

1.3.7 流式细胞术检测CD235a与CD71的表达 利用hemin诱导培养电转染对照和RPL15-shRNA质粒的K562细胞72 h，收集1×106个K562细胞，PBS冲洗2遍，用100 μL PBS重悬细胞，每管添加5 μL APC-CD71和2.5 μL PE-CD235a直标一抗，轻柔混匀后于冰上避光孵育30 min。PBS洗涤细胞2遍，细胞重悬于1 mL PBS中，FC500流式细胞分析仪上机进行检测，实验重复3次。

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2.2RPL15-shRNA质粒干扰效率的检测qPCR结果显示，与对照组相比，RPL15-shRNA2质粒能有效下调K562细胞中RPL15的mRNA表达水平（n=3，F=14.901，P＜0.01），见图2A。Western blot实验结果显示，与对照组和RPL15-shRNA1组相比，RPL15-shRNA2质粒能有效下调K562细胞中RPL15的蛋白表达水平（n=3，F=231.208，P＜0.01），见图2B、C。采用RPL15-shRNA2质粒进行后续相关实验。

2 结果

1.3.6 TMB染色检测K562细胞红系分化过程中血红蛋白表达情况 采用电转染方式将NC-shRNA（对照组）和RPL15-shRNA2质粒导入K562细胞中，将转染后的细胞培养于含有hemin的培养液中，分别设置0、24、48和72 h组。向1 mL 0.4%TMB中加入5 μL 30%双氧水混匀即为染色液，染色液现配现用。取hemin诱导不同时间点K562细胞，离心收集，PBS洗1遍后，重悬于200 μL PBS中。取50 μL上述细胞悬液加入50 μL染色液混匀后，室温放置2～3 min。吹打均匀后取一滴于载玻片上，显微镜下拍照。另取细胞悬液在血球计数板上计数500个细胞，计算联苯胺阳性细胞比例（利用联苯胺阳性细胞比例来代表不同时间点合成血红蛋白K562细胞的数量。通过联苯胺染色阳性率，结合时间分组，说明K562细胞红系分化情况），实验重复3次。联苯胺染色阳性细胞百分率越高，提示该组总的血红蛋白含量越高。

1.4 统计学方法 使用Graphpad Prism 8.0对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2个样本均数比较采用两独立样本t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnet-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3.5 Western blot实验检测RPL15蛋白的表达 检测RPL15蛋白的表达变化：使用hemin诱导K562细胞向红系分化，分别设置0、24、48、72、96和120 h组。检测RPL15蛋白的干扰效率：将RPL15-shRNA质粒电转染至K562细胞中，培养72 h后收集适量K562细胞。提取各组细胞总蛋白，采用12%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，封闭液封闭2 h，加入兔抗人RPL15单克隆抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，洗膜液洗膜3次后加入山羊抗兔二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，洗膜后曝光显像，实验重复3次。

Fig.1 Changes of RPL15 expression during erythroid differentiation of K562 cells图1 RPL15在K562细胞红系分化过程中的表达水平变化

Fig.2 Interference efficiency of RPL15-shRNA plasmid in K562 cells图2 RPL15-shRNA质粒在K562细胞中的干扰效率

Fig.3 Changes of hemoglobin expression in K562 cells before and after RPL15 interference(×200)图3 RPL15干扰前后K562细胞中血红蛋白表达变化（×200）

2.4RPL15对K562细胞红系分化的影响qPCR结果显示，RPL15-shRNA2组中α-、β-、ε-和γ-珠蛋白基因的相对表达量均显著低于对照组（均P＜0.05），见表3。流式细胞术检测结果显示，RPL15-shRNA2组CD235a+CD71+细胞比例较对照组显著降低（43.10%±3.15%vs.62.07%±2.97%，n=3，t=7.590，P＜0.01），见图4。

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of globin gene between the two groups表3各组珠蛋白基因mRNA表达水平的比较（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of globin gene between the two groups表3各组珠蛋白基因mRNA表达水平的比较（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表4同

组别 α-globinβ-globinε-globinγ-globin对照组1.01±0.021.01±0.021.01±0.021.01±0.02 RPL15-shRNA2组0.76±0.110.60±0.070.63±0.030.78±0.12 t 3.911＊9.969＊＊15.830＊＊3.292＊

Fig.4 Knockdown of RPL15 inhibited the expression of erythroidrelated genes in K562 cells图4在K562细胞中敲低RPL15抑制红系相关基因表达

2.5RPL15对红系分化相关信号通路分子表达的影响qPCR结果显示，与对照组相比，RPL15-shRNA2组P53的mRNA表达水平显著上调（P＜0.01），而GATA1和HSP70的mRNA表达水平均显著下调（均P＜0.01），见表4。

Tab.4 Comparison of expression levels of P53,GATA1 and HSP70 mRNA between the two groups表4各组P53、GATA1及HSP70 mRNA表达水平的比较（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of P53,GATA1 and HSP70 mRNA between the two groups表4各组P53、GATA1及HSP70 mRNA表达水平的比较（n=3，±s）

组别HSP70GATA1P53对照组1.02±0.031.02±0.031.02±0.03 RPL15-shRNA2组0.61±0.130.75±0.091.77±0.20 t 5.486＊＊4.917＊＊6.517＊＊

3 讨论

3.1RPL15与DBA的联系 目前研究表明核糖体蛋白与DBA的发生密切相关，DBA是一种罕见的先天性红细胞减少和遗传性骨髓衰竭综合征，其主要特征是患者骨髓中髓系成熟正常，但选择性地缺乏红细胞前体［7］。目前研究发现多数诱使DBA遗传病变的基因属于核糖体蛋白基因家族，因此DBA被认为是一种核糖体疾病［8-9］。近年来，与DBA疾病相关的核糖体蛋白突变研究在细胞水平上陆续开展。在利用RNAi技术下调原代人造血干细胞的研究中发现，与其他谱系相比，下调RPS19选择性诱使人红系造血祖细胞发生细胞周期阻滞［10］。此外，研究发现RPL11突变导致红系祖细胞增殖显著下降，红系分化延迟［11］。上述研究提示相关核糖体蛋白突变与红系分化密切相关。值得注意的是，已有研究在DBA患者中发现RPL15基因的突变［12］。鉴于RPL15在DBA疾病中的生物学功能及具体作用机制尚未阐述清晰。本研究利用RNAi技术成功下调K562细胞中的RPL15，初步探究RPL15对K562细胞红系分化的影响。

3.2 抑制RPL15的表达将抑制K562细胞红系分化 本实验结果表明RPL15在K562细胞红系分化过程中表达呈先升高后下降的趋势。由于原始红细胞增殖分化约72 h后需要脱核及去除细胞器而进一步分化为成熟红细胞，因此在K562细胞红系分化前期过程表达升高可能提示RPL15是潜在的促进红系分化的因子。沉默RPL15表达后诱导K562细胞向红系分化发现，与对照组相比，RPL15敲低使细胞内α-、β-、ε-和γ-珠蛋白的mRNA表达水平降低；此外，红系细胞表面特异的糖蛋白标志分子CD235a和红系分化标志物CD71双阳性细胞比例降低。上述结果提示，抑制RPL15的表达将抑制K562细胞红系分化，进一步证实RPL15是潜在的促进红系分化的因子。

3.3RPL15调控红系发育分子通路的探讨 相关研究证实，核糖体蛋白突变诱使的DBA患者贫血表型的形成与P53通路密切相关［13］。本研究结果显示，在K562细胞向红系分化过程中，沉默RPL15使得细胞中P53mRNA表达水平增高。当RPL15发生突变时，核糖体的正常装配过程出现失衡，将导致核糖体前体RNA降解和在核仁内产生游离核糖体蛋白［14］。游离核糖体蛋白可进入核基质与鼠双微染色体2基因（murine double mimute2，MDM2）结合［15］。在与上述游离核糖体蛋白结合后，MDM2的泛素连接酶的活性受到抑制，而这会诱使P53基因的表达增高，从而导致相应细胞周期停滞和凋亡的发生［16］。此外，有研究表明红系分化过程中HSP70可从细胞质迁移到细胞核而结合GATA1，以保护GATA1免受caspase-3介导的裂解，从而调控红系正常分化发育［17-19］。本研究结果显示，在K562细胞向红系分化中，沉默RPL15表达使GATA1及HSP70的mRNA表达水平发生下调，提示HSP70转录水平的下调将诱使GATA1发生caspase-3介导的裂解，进一步导致RPL15敲低细胞的红系分化障碍。

综上所述，本研究通过RNAi技术敲低K562细胞中的RPL15，发现抑制RPL15的表达将抑制K562细胞的红系分化，进一步提示RPL15是潜在的正向调控红系分化的因子。此外，初步探究表明P53相关通路、GATA1及HSP70可能参与了RPL15敲低对K562细胞红系分化的调控过程，为进一步探究RPL15在相关红系疾病发生发展中的作用奠定了实验基础。