Notch信号通路在肝纤维化中的研究进展

张望，万义鹏，朱萱

肝纤维化是各种慢性损伤因素（如病毒、乙醇、胆汁淤积等）刺激肝脏后引起细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积和纤维瘢痕形成的一种病理过程［1］。肌成纤维细胞是肝纤维化发生过程中ECM的主要来源，持续进展的肝纤维化可演变为肝硬化，甚至肝癌，严重威胁人类健康。肝纤维化本质是肝脏的一种修复反应，大量研究已表明肝纤维化是可逆的［1-3］。肝纤维化发病机制非常复杂，众多信号通路参与其发生发展，如转化生长因子β（TGF-β）/Smad信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、Wnt/β-连环蛋白信号通路、Hedgehog 信号通路和 Notch 信号通路等［4］。其中，Notch 信号通路在肝纤维化的发病过程中起重要作用，抑制Notch信号通路能明显减少肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化，抑制肝纤维化发生。本文就Notch信号通路在肝纤维化中的研究进展作一综述。

1 Notch信号通路概述

Notch 信号通路是一个进化上高度保守的信号通路，Notch 突变体最早在果蝇中被发现，因其突变会导致果蝇翅膀发生缺刻而得名。随着研究的深入，目前发现大多数多细胞生物存在Notch 信号通路，其通过介导细胞间相互作用与组织器官发育、稳态维持和多种肝脏疾病的发生密切相关［5］。

1.1 Notch 信号通路的组成与结构 Notch 信号通路由Notch 受体、配体和DNA 结合蛋白组成。在哺乳动物中，目前已发现Notch 信号通路有4 个受体（Notch1～4）和 5 个经典配体［Delta-like（DLL）1、DLL3、DLL4、Jagged（JAG）1 和 JAG2］［6］。Notch 受体是单次跨膜异二聚体，由Notch 细胞外结构域、跨膜区和Notch细胞内结构域（NICD）3部分组成。Notch细胞外结构域包含29～36 个串联的表皮生长因子（EGF）样重复序列和1个负性调控区域（NRR），EGF样重复序列为受体与配体结合所必需，在没有配体的情况下，NRR 在阻止受体激活方面起到关键性作用［7］。NICD 包含一些核定位序列、1 个反式激活区和1个富含脯氨酸（P）-谷氨酸（E）-丝氨酸（S）-苏氨酸（T）的PEST 序列，PEST 序列与NICD 的稳定性相关［8］。经典的Notch 配体同受体类似，也是跨膜蛋白，其细胞外结构域包括多个串联的EGF 样重复序列、Delta-Serrate-LAG2（DSL）结构域和氨基末端（NT）结构域，串联的EGF样重复序列能够增强配体与受体的亲和力，DSL结构域和NT结构域为配体与受体结合并激活Notch信号所必需［9］。

1.2 Notch 信号通路的活化 在经典Notch 信号通路中，Notch 受体前体在内质网中合成后，经高尔基体中的Furin样蛋白转化酶在S1酶切位点处酶切后形成异二聚体形式的成熟Notch受体，然后转运至细胞膜形成单次跨膜的异二聚体Notch 受体［10］。当Notch 受体与相邻细胞的Notch 配体结合后，受体与配体相互作用诱导Notch 受体构象改变，导致Notch受体细胞外结构域中的去整合素金属蛋白酶（ADAM）酶切位点（S2 酶切位点）暴露，经过ADAM酶切后，γ 分泌酶复合物在跨膜区的S3 酶切位点处进一步酶切截断的Notch 受体，随后NICD 释放进入胞质，转移至细胞核同DNA结合蛋白C-启动子结合因子1/hairless 抑制因子/Lag-1（C-promoter binding factor 1/Suppresor of hairless/Lag-1，CSL）结合。当缺乏NICD时，CSL作为转录抑制因子与一系列共抑制因子如视黄醇和甲状腺激素受体的沉默介质（SMRT）、CBF1 相互作用共抑制因子（CIR）、SKI 相互作用蛋白（SKIP）等结合导致转录抑制，当NICD与CSL结合后，CSL转变为转录激活因子并募集共激活因子（MAML）形成NICD/CSL/MAML 转录复合物，进而启动下游靶基因如Hes、Hey 等的转录与表达［11］。Notch 受体与相邻细胞的Notch 配体结合后活化Notch信号，此即反式相互作用；Notch受体也可与同一细胞表面的Notch配体结合，但产生的效应是抑制Notch 信号，此为顺式相互作用；反式相互作用和顺式相互作用对决定细胞是信号接收细胞还是信号发送细胞十分重要［9］。

除经典Notch信号通路激活途径之外，还有一部分Notch 信号是通过非经典Notch 信号通路实现的。非经典Notch信号通路在果蝇中被广泛研究，目前在哺乳动物中的研究较少，其具体的调控机制尚不明确。非经典Notch 信号通路主要包括DSL 配体（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1 和 Jagged2）非依赖性Notch信号、蛋白酶非依赖性Notch信号、CSL非依赖性Notch 信号、Notch 靶基因的非经典活化等［12］。在哺乳动物中，Delta样非经典Notch配体1（Dlk1）具有生长调节作用，其通过Notch依赖和非依赖机制参与调节组织器官（如肝脏）的发育和再生过程［13］。

1.3 Notch 信号通路的调控 在Notch 信号传递过程中，有多种机制参与调控Notch 信号通路。DNA甲基化是研究最广泛的表观遗传调控机制，其改变不仅参与调节HSCs活化和肝纤维化发生，而且可直接影响Notch 受体的表达［14］。在新鲜分离的HSCs中，Notch1 受体表达明显高于Notch3 受体，而Notch3 DNA 甲基化水平明显高于Notch1；在原代HSCs培养活化过程中，Notch3位点DNA逐渐去甲基化，Notch3受体表达显著上调，而Notch1则呈现相反的趋势，这表明DNA甲基化调节Notch受体表达［15］。Deltex4 是Notch 信号通路的重要调节因子，其对Notch 信号通路的调控效应取决于细胞类型和相互作用的分子，在HSCs 活化过程中，Deltex4 启动子DNA 甲基化降低，Deltex4 基因表达增加，伴随HSCs Notch3 受体表达上调，Notch1 和 Notch4 受体表达减少［16］。泛素化是蛋白质翻译后修饰的重要方式，蛋白质泛素化通常使蛋白质更易于降解。在肝纤维化过程中，E3 泛素连接酶WW 结构域包含蛋白2（WWP2）促进NICD3 单泛素化，增加NICD3 溶酶体途径降解，蛋白磷酸酶1G通过与WWP2相互作用负向调控WWP2 活性，而中药单体木香烃内酯能够阻断蛋白磷酸酶1G与WWP2复合体形成，促进NICD3降解，进而抑制Notch3/Hes1 通路和肝纤维化发生［17］。非编码RNAs 是一类从基因组转录产生的但不编码蛋白质的RNA，其作为调节因子广泛参与各种生物学功能。microRNA 是非编码RNA 的重要组成部分，在转录后水平参与调节基因表达。在HSCs中，miRNA-25-3p 靶向抑制Notch 信号（共）激活因子ADAM-17 和 FK506 结合蛋白14（FKBP14），减少Notch1 受体裂解和NICD1 核移位，进而抑制Notch1信号和肝纤维化［18］。在 TGF-β1 刺激活化的 HSCT6细胞中，miR-200a通过靶向负性调控Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRT1 而上调Notch1 表达，进而抑制HSC-T6 活化和纤维化形成［19］。除 miRNA 外，长链非编码RNA（lncRNAs）也参与调控Notch信号通路。肝纤维化相关lncRNA1（lnc-LFAR1）可直接与Smad2/3结合，促进TGF-β、Smad2、Smad3、Notch2和Notch3 转 录 ，沉 默 lnc-LFAR1 可 抑 制 Notch2、Notch3、Hes1 和 Hey2 表达，这表明 lnc-LFAR1 通过活化 TGF-β 和 Notch 信号通路促进 HSCs 活化和肝纤维化发生［20］。lncRNA Meg8 在活化的HSCs、受损的肝细胞和纤维化肝脏中表达上调，而沉默lncRNA Meg8 可促进原代 HSCs 和肝细胞 Notch2、Notch3 和Hes1 表达，提示 lncRNA Meg8 通过抑制 Notch 信号通路抑制HSCs活化和肝细胞上皮间充质转化［21］。

2 Notch信号通路与肝纤维化

2.1 Notch信号通路与HSCs HSCs是位于Disse 间隙内的肝脏间质细胞，正常情况下，HSCs 处于静止状态，胞质内有多个富含维生素A的脂滴，是机体储存维生素A的主要细胞［1］。在各种肝损伤因素刺激作用下，静止型HSCs 发生活化。大量研究表明HSCs 活化、增殖是肝纤维化发生的中心事件，活化的HSCs形态和功能发生一系列改变，转变为肌成纤维细胞，分泌大量的细胞外基质，导致肝纤维化。众多信号通路参与HSCs 活化，其中Notch 信号通路具有重要作用。在原代HSCs 体外培养活化过程中，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原、N-钙黏蛋白、Notch 2、Notch 3及Notch靶基因Hey2、HeyL表达上调，E-钙黏蛋白和上皮细胞标志细胞角蛋白（CK）-19、CK-7表达下调，提示原代HSCs体外培养时Notch信号通路活化和存在自发上皮间充质转化，而使用Notch受体阻断剂DAPT可显著抑制α-SMA、Ⅰ型胶原和N-钙黏蛋白表达，增加E-钙黏蛋白和上皮细胞标志CK-19、CK-7表达，表明Notch信号通路参与HSCs 活化和上皮间充质转化［22］。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）上调肝星状细胞LX2 Notch1 和Notch信号通路下游Hes1 和Sox2 蛋白表达，促进HSCs 增殖，沉默Notch1抑制Sox2蛋白表达和HSCs 增殖，提示AngⅡ通过激活Notch1/Sox2通路促进肝星状细胞LX2 增殖［23］。在肝纤维化大鼠和 TGF-β1 活化的HSCs 中，Notch3、jagged 经典 Notch 配体 1（JAG1）和Hes1 表达上调，基因沉默JAG1 抑制HSCsⅠ型胶原和α-SMA表达，表明激活Notch信号通路促进HSCs活化和肝纤维化发生，进一步研究发现miR-489-3p通过与JAG1 mRNA 3'非编码区相互作用靶向下调JAG1表达、负向调节JAG1/Notch3信号通路，进而抑制HSCs 活化［24］。在活化HSCs 中，Hes1 和昼夜节律分子神经元PAS结构域蛋白2（NPAS2）表达增加，过表达Hes1 或NPAS2 促进HSCs 活化和胶原沉积，敲低Hes1 或NPAS2 则产生相反的效应，同时，过表达或敲低NPAS2，HSCs中Notch受体无明显改变，进一步荧光素酶报告基因检测提示NPAS2 直接转录激活HSCs 中的 Hes1，进而促进 HSCs 活化［25］。这提示NPAS2 是通过非经典Notch 信号通路活化Notch 信号，促进HSCs活化和肝纤维化发生的。

2.2 Notch 信号通路与巨噬细胞 巨噬细胞是机体非特异性免疫系统的重要组成部分，肝脏巨噬细胞包括肝内定居的枯否细胞和来源于骨髓的单核细胞源性巨噬细胞。巨噬细胞在肝纤维化的发病机制中具有双重调控作用，在肝纤维化形成期，巨噬细胞释放多种促炎细胞因子或趋化因子活化HSCs，促进细胞外基质沉积和纤维化发生。在肝纤维化逆转期，巨噬细胞分泌抗炎细胞因子抑制炎症，促进细胞外基质降解，减轻肝纤维化［26］。在肝纤维化发生过程中，Notch信号通路通过参与巨噬细胞活化促进肝纤维化发生发展。感染血吸虫小鼠的肝脏巨噬细胞表现为M2型极化，Notch1/Jagged1信号在M2型巨噬细胞中表达显著上调，应用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch 信号通路可逆转巨噬细胞M2 型极化，减轻血吸虫病小鼠肝脏肉芽肿和纤维化，这表明依赖Notch1/Jagged1信号的巨噬细胞M2型极化在血吸虫病肝肉芽肿和纤维化中具有重要作用［27］。在脂肪肝的发病机制中，DLL4-Notch轴促进促炎巨噬细胞活化，增加胰岛素抵抗，加重脂肪肝［28］。在四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型中，辣椒素通过抑制Notch 信号减少M1 型巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α），进而抑制肌成纤维细胞再生和肝纤维化形成，这表明Notch信号通路通过调节肝脏巨噬细胞功能参与肝纤维化形成［29］。在细胞共培养体系中，Notch 信号在HSCs 和巨噬细胞中的相互作用决定了肝纤维化形成的转归，活化的HSCs促进促炎巨噬细胞极化，应用γ-分泌酶抑制剂预处理HSCs 后则可抑制促炎巨噬细胞极化，促炎巨噬细胞也可促进HSCs 活化，而应用γ-分泌酶抑制剂预处理促炎巨噬细胞后也可抑制HSCs 活化［30］。这表明不同类型细胞间Notch 信号相互作用也参与肝纤维化的发生。

2.3 Notch 信号通路与肝细胞 肝细胞是肝脏中数量最多的细胞，各种损伤因素刺激肝脏后，肝细胞通过旁分泌、凋亡等机制活化HSCs，促进肝纤维化形成。肝细胞Notch 信号通路通过改变肝细胞功能影响HSCs 活化和肝纤维化发生。雷公藤内酯通过抑制肝细胞中Notch1介导的PTEN/Akt/Txnip信号传导而损害硫氧还蛋白系统，启动肝细胞氧化应激，进而导致肝细胞凋亡和肝损伤，而过表达NICD1 则抑制雷公藤内酯诱导的肝细胞凋亡和肝损伤，表明Notch1对雷公藤内酯诱导的肝细胞毒性具有保护作用［31］。在肝纤维化过程中，特异性表达于肝细胞的lnc-Hser 表达显著减少，沉默lnc-Hser 上调肝细胞Notch2、Jagged1 和 Hes1 表达，增加间充质标志基因N-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛家族转录抑制因子1表达，促进肝细胞上皮间充质转化，而应用Notch 受体阻断剂则能够抑制lnc-Hser沉默所诱导的肝细胞上皮间充质转化，表明Notch信号通路促进肝细胞上皮间充质转化［32］。正常肝脏中肝细胞Notch 信号几乎完全被抑制，而在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者中，肝细胞Notch 活性与病情的严重程度呈正相关，特异性活化肝细胞Notch信号加重饮食诱导的小鼠NASH和肝纤维化，特异性失活肝细胞Notch信号则能够阻断NASH 相关肝纤维化，表明NASH 饮食诱导的肝纤维化的发展依赖肝细胞Notch信号活化，进一步研究发现，Notch活化介导肝细胞骨桥蛋白分泌，进而促进HSCs活化和肝纤维化，药物抑制Notch信号通路则减轻NASH相关肝纤维化［33-34］。

2.4 Notch 信号通路与肝窦内皮细胞 肝窦内皮细胞（LSECs）是肝脏中最丰富的非实质细胞群。在正常情况下，LSECs具有独特的窗孔结构，并缺乏基底膜，这些结构特点让LSECs具有高通透性，有利于肝细胞和肝血窦之间进行物质交换。LSECs在维持肝内稳态中具有重要作用，其通过阻止枯否细胞与HSCs 活化，调节肝内血管阻力和门脉压力，具有抗炎、抗纤维化特性［35］。在病理状态下，LSECs窗孔消失，并伴随基底膜形成，此即肝窦毛细血管化，肝窦毛细血管化与肝纤维化的发生密切相关。在纤维化肝脏和体外培养的原代LSECs中，CD31和血管性血友病因子（vWF）表达增加，LSECs 窗孔数量明显减少，提示肝窦毛细血管化，同时伴随Notch配体DLL4表达上调，过表达DLL4 促进LSECs 基底膜形成和HSCs 对肝窦的覆盖，而应用Notch 信号通路阻断剂DAPT或沉默DLL4则抑制LSECs窗孔缺失和基底膜形成，减轻CCl4诱导的肝纤维化。这表明DLL4通过调节肝窦毛细血管化促进肝纤维化形成［36］。生理状态的LSECs 通过产生一氧化氮维持HSCs 处于静止状态，并促进活化的HSCs 逆转为静止状态，毛细血管化的LSECs一氧化氮产生减少，这有利于HSCs活化［37］。内皮特异性Notch 活化抑制内皮型一氧化氮合酶/可溶性鸟苷酸环化酶信号，导致LSECs毛细血管化，进而促进HSCs活化和肝纤维化［38］。

3 总结与展望

综上所述，Notch信号通路在肝纤维化的发病机制中具有重要作用，其通过介导细胞间相互作用与组织器官发育和稳态维持密切相关，非特异性抑制Notch信号通路将产生一系列不良反应。因此，靶向阻断Notch 信号通路或传递Notch 抑制剂为更佳的治疗策略。最近有研究表明靶向传递Notch 抑制剂能够改善饮食诱导的小鼠糖耐量异常和NASH相关肝纤维化，避免胃肠道不良反应［39］。目前对于非经典Notch 信号通路在肝纤维化中的作用了解尚少。由于其与多条信号通路密切相关，故研究非经典Notch 信号通路在肝纤维化中的作用有利于进一步认识肝纤维化的发病机制和开发新的抗纤维化方案。