尿液microRNA-21表达联合三维超声成像技术对膀胱尿路上皮癌的诊断价值

王琳，宣之东，张颖，刘永容，李超，姜利宁

膀胱肿瘤为我国近年来泌尿系统最常见的肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势［1］。其中膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）最为常见，复发率较高，且易于转移［2］。准确的临床诊断对手术方式的选择、疗效判断以及预后评估有重要价值。微小RNA（microRNA，miR）是一类内源性小分子非编码RNA，在转录后起调控基因表达的作用［3］。既往研究证实，miR-21 与膀胱癌的发生发展密切相关，参与膀胱癌细胞的增殖、侵袭等过程［4］。研究发现BUC 患者的尿液miR-21 表达上调，且稳定性较高，可作为BUC 诊断及预后判断的无创尿液标志物［5］。此外，三维超声成像技术（three-dimensional ultrasonography，3D-US）具有全面的解剖可视化、高分辨率和实时评估的优势，可用于膀胱癌的筛查［6］。目前，尿液miR-21 表达联合3D-US 对尿路上皮癌诊断价值的相关研究较少。本研究通过检测BUC患者和泌尿系良性疾病患者尿液miR-21表达差异，探讨BUC 患者尿液miR-21 表达与组织病理学特征的关系，并分析尿液 miR-21 联合 3D-US 对 BUC 的诊断效能，以期为BUC 诊断提供一项操作便捷且相对无创的可靠技术。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016 年3 月—2020 年5 月于河北省沧州市中心医院行尿道肿瘤电切术并经病理确诊为BUC 的初发膀胱癌患者，经排除患有其他部位肿瘤者后，最终纳入病例组78 例，其中男 55 例，女23 例，平均年龄（67.5±8.7）岁。BUC 病理分级按世界卫生组织（WHO）2004 分级标准，临床分期按国际抗癌联盟2009年第7版TNM分期标准。78例患者中，非肌层浸润性BUC（非浸润组）57 例，肌层浸润性BUC（浸润组）21 例；低级别BUC（低级别组）52 例，高级别BUC（高级别组）26 例。同期，收集我院确诊并经病理证实的80例良性泌尿系疾病患者作为对照组，其中男52 例，女28 例，平均年龄（63.9±7.1）岁。2 组间性别（χ2=1.107）、年龄（t=0.918）差异无统计学意义。本研究通过医院伦理委员会审核，研究对象均签署知情同意书。

1.2 3 D-US检查 采用Philips Epiq 7型多功能超声显像仪，使用CH4-1 腹部凸阵探头频率3.5 MHz，三维探头频率3.5～5.0 MHz，机械指数0.05，增益50 dB。待患者膀胱呈适当充盈状态后，行常规二维超声，检查患者膀胱的三角区水平、左右侧壁、膀胱前壁和后壁区域，选取最佳切面后转换至3D-US模式，通过耻骨联合上方腹壁多角度扫描膀胱肿瘤。嘱患者减慢呼吸强度，尽量屏气，采集动态图像时间5 min，并自动保存于仪器硬盘。每例患者在15～20 min 内完成3D-US 检查，以上操作均由2名经验丰富的超声科主治医师进行。

1.3 实时荧光定量PCR（qPCR）检测尿液miR-21 收集病例组及对照组患者晨尿25 mL，2 000 r/min 离心10 min，将尿液沉淀分离，500 mL 磷酸盐缓冲盐水洗涤2 次，mirVanaTm PARIS miRNA试剂盒（ABI公司，美国）提取RNA，以-80 ℃储存待进一步使用。以上提取的RNA 根据Taqman miRNA 逆转录试剂盒（ABI 公司，美国）进行逆转录后得到cDNA。逆转录的条件为：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，4 ℃5 min，反应结束后4 ℃保存。采用PRISM 7900 系统（ABI 公司，美国）进行qPCR。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，72 ℃退火并延伸30 s，共45个循环。应用ΔΔCt方法进行标准化，以U6作为内参照，计算miR-21相对表达水平。以对照组作为标化样本，用于计算ΔΔCt。ΔΔCt=ΔC（t待测样本）-ΔC（t标化样本），相对量（relative quantity，RQ）=2-ΔΔCt。

1.4 尿细胞学检查 载玻片固定于专用离心管中，将尿液样本放入离心管中，1 700 r/min 离心5 min，取出载玻片作巴氏染色。取细胞学涂片后，无水乙醇脱水10 min，二甲苯清除1 min，密封后送病理学镜检。尿细胞学诊断结果分为4 类：（1）阴性（NEG），上皮细胞病变在正常范围，无非典型细胞和恶性细胞。（2）非典型性尿路上皮细胞（AUC），上皮细胞异型性明显，但无明确的恶性特征。（3）可疑癌（SUCA），上皮细胞呈恶性变化，但数量和质量不足以诊断癌症。（4）癌（CA），具有恶性特征的上皮细胞。尿细胞学诊断结果中NEG 和AUC为阴性，SUCA和CA为阳性。

1.5 膀胱镜检查 患者取截石位，局部麻醉后置入膀胱镜（Wolf 30，德国）。对整个膀胱黏膜和输尿管的开口进行详细检查。如发现病灶取活检送病理。以上操作由高年资主治医师进行。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，2 组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例表示。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析尿液miR-21 和3D-US 对BUC 的诊断价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BUC 患者尿液miR-21表达与临床病理特征的关系 qPCR 结果显示，病例组患者尿液miR-21 的相对表达量显著高于对照组（2.49±0.82vs.1.00±0.00，t=11.183，P＜0.05）。浸润组尿液miR-21 表达明显高于非浸润组，高级别组高于低级别组（P＜0.05）；不同年龄、性别患者之间尿液miR-21表达水平差异均无统计学意义，见表1。

Tab.1 The relationship between urine miR-21 expression and clinicopathological features in patients with BUC表1 BUC患者不同临床特征分类与尿液miR-21表达的关系

2.2 尿液miR-21 联合3D-US 诊断BUC 尿液miR-21、3D-US、尿液miR-21联合3D-US、膀胱镜和尿细胞学的诊断实验结果见表2、图1。尿液miR-21联合3D-US检查敏感度和特异度均较高，Youden指数为0.911，接近于膀胱镜检查的Youden 指数0.912。典型BUC患者3D-US图像见图2。

Tab.2 The diagnostic efficacy of different examination methods for urothelial carcinoma表2 不同检查方法评估尿路上皮癌的诊断效能

Fig.1 ROC curve of diagnostic value of different examination methods for BUC图1 不同检查方法对BUC诊断价值的ROC曲线

Fig.2 3D-US image of a patient with urothelial carcinoma of the bladder图2 BUC患者的3D-US图像

3 讨论

BUC 是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，准确的临床诊断对BUC 手术方式的选择、预后和临床随访具有重要价值。目前，膀胱镜、尿细胞学及超声检查是BUC 最常用临床诊断方法。膀胱镜检查可以提高BUC的诊断率，但其仍然是一项有创、复杂，且费用较高的技术。此外，患者对膀胱镜检查的接受度和持续性较低，通常会影响患者及时诊断和持续监测。尿细胞学检查虽为无创，但对BUC 诊断的敏感度较低［7］。本研究中尿细胞学检查敏感度仅为62.82%。传统二维超声检查无创且便捷，易于被患者接受，然而其对体积较小或分布于膀胱顶部和前壁区域的肿瘤存在监测难度较大等局限性，使其缺乏全面的解剖可视化。与二维超声相比，3D-US 的主要优势在于其多方位的观察视角和不同的观察算法，可以通过表面绘制和多平面重建等技术来显示数据。3D-US在评价解剖结构方面已被证实较二维超声更具可靠性及可重复性［8］。

miR 在癌细胞的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用［9］。既往研究表明miR能够通过与抑癌基因mRNA序列上相应的位点结合，调控基因表达，促进肿瘤的发生［10］。miR-21 是进化上高度保守的miR，在肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤病程中均呈高表达且与肿瘤病情的进展密切相关［11-12］。Szarvas等［13］对膀胱尿路上皮癌筛查研究发现尿液上清可显示80%的肿瘤畸变。既往研究发现，尿液miR 分子表达筛查膀胱癌有较高的敏感度和特异度［14］，且尿液miR-21分子表达的稳定性较高，具备无创检测的优点，可作为BUC 诊断、预后和临床随访的良好分子标志物［15］；但目前关于 BUC 病灶内 miR-21 表达水平的变化趋势尚未明确。

本研究对比分析78 例BUC 患者和80 例良性泌尿疾病患者尿液miR-21 表达水平，结果显示BUC患者尿液miR-21 表达水平与良性泌尿系疾病患者相比显著升高，提示尿路上皮癌患者尿液miR-21表达上调可能与其致癌作用存在密切关系。进一步分析表明，不同的肿瘤分期、分级BUC 患者尿液miR-21 表达水平不同，而与年龄和性别无关，提示尿液miR-21 表达与尿路上皮癌的组织病理学特征存在相关性。ROC 曲线结果提示尿液miR-21 对BUC 有一定诊断价值，但单一应用尿液miR-21 水平诊断BUC，其敏感度仍不足（82.05%），在临床上诊断BUC尚缺乏说服力，无法完全代替膀胱镜。本研究应用尿液miR-21 表达联合3D-US，探索具有较高敏感度、无创且便捷的BUC 联合诊断模式。在临床诊断中，将 BUC 患者的尿液 miR-21 表达和 3D-US 检查结果做并联试验，只要其中一项检查阳性即认为联合检测阳性，只有两项检查结果均为阴性才认为联合检测阴性，结果表明，3D-US 诊断BUC 的特异度较高（91.25%）、敏感度较低（78.21%），而尿液miR-21 表达联合3D-US 诊断BUC 的敏感度和特异度均较高（94.87%、96.25%），Youden 指数（0.911）与膀胱镜（0.912）接近，且阴性预测值高达95.06%。

综上所述，尿路上皮癌患者尿液miR-21表达上调，且与组织病理学分期、分级有关。尿液miR-21表达联合3D-US 可作为一项筛查BUC 有效且无创的诊断方法，能够有效辅助BUC 患者的术前诊断、临床治疗方案选择及预后判断。