MicroRNA-27b介导沉默同源盒蛋白HOXB8对人胃癌干细胞样特性的调节作用

杨向超，田由京，陈 禺，李 合

(海南医学院第一附属医院普通外科，海南 海口 570102)

胃癌(gastric cancer)是消化系统中常见的恶性肿瘤疾病，死亡率位于第三位[1]。近年来，尽管在分子靶向治疗方面取得了重大的进展，但由于耐药性和复发性的出现，使得胃癌患者的中位生存率仍然很低。实验证据表明，肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)是临床放射疗法和化学疗法不敏感的重要原因，也是肿瘤转移和复发的关键因素[2]。胃癌干细胞在胃癌进程中起着至关重要的作用，消除胃癌干细胞将大大有助于胃癌的治疗。MicroRNA(miRNA)是一类保守的非编码小RNA，通过与靶mRNA的3'UTR结合来抑制基因表达，在肿瘤干细胞的特性如自我更新、侵袭和肿瘤发生中均发挥作用[3]，目前已成为癌症诊断研究的重点内容，可能是临床抗肿瘤治疗的一项新策略。miR-27b是位于C9orf3基因第14个内含子，以往研究表明，miR-27b参与多种肿瘤发生发展的关键环节，包括细胞周期、分化、转移及黏附等[4]。同源盒蛋白B8(Homeobox B8，HOXB8)属于HOX基因家族成员，是胚胎发育过程中的特异性转录因子，可在不同部位和不同组织中表达，并与多种肿瘤(如结直肠癌、宫颈癌、肺癌、恶性胶质癌等)的发生、发展有密切的相关性[5,6]。本研究通过检测胃癌组织中miR-27b与HOXB8表达，并通过脂质体介导方法在胃癌干细胞中过表达miR-27b，探究其对胃癌干样细胞的生物学特性的影响，以期为寻找新的胃癌治疗策略提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1临床资料：收集30例胃癌组织及距癌组织边缘5 cm以上的癌旁正常组织，均为我院2018年6月至2020年6月胃癌手术切除标本，其中男性患者21例，女性患者9例，年龄28～71岁，平均(48.23±5.16)岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗等辅助治疗，临床资料完整。所有病例标本由2位专业的病理科副主任医师诊断，患者及家属均签署知情同意书，本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与材料:人胃癌细胞株SGC-7901(中国科学院细胞库)，B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、白血病抑制因子、DMEM/F1培养液(美国Hyclone)，Trizol试剂盒和Lipofectamine 3000试剂盒(美国 Invitrogen)，TaqMan®advanced miRNA cDNA Synthesis试剂盒和TaqMan advanced miRNA Assays试剂盒(Genecopoeia公司)，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(日本Takara)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(南京诺维赞)，CD44+磁珠分选试剂盒(美国Thermo Scientific)，免疫荧光染色试剂(南京凯基生物)，BCA蛋白检测试剂盒、PVDF膜、结晶紫染液和ECL试剂液(上海碧云天)，CCK-8试剂盒和EdU染色试剂盒(杭州四季青)，兔抗人HOXB8(英国Abcam)，鼠抗人GAPDH和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(上海昊鑫生物)。miR-27b mimic与阴性对照、WT-HOXB8 3’-UTR质粒载体与MUT-HOXB8 3’-UTR质粒载体均交由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。

1.3方 法

1.3.1实时荧光定量PCR:将收集的胃癌组织及癌旁正常组织在无菌超净台剪碎，加入液氮研磨匀浆，Trizol试剂抽提总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度、浓度。根据TaqMan®advanced miRNA cDNA Synthesis试剂盒进行反转录获取miRNA的cDNA，利用TaqMan advanced miRNA Assays试剂盒检测组织中miR-27b表达，以U6作为内参。扩增条件为：95℃，10 min，循环1次；95℃，15 s，60℃，60 s，循环40次；根据PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书进行反转录获取HOXB8基因的cDNA，按照SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒检测组织中HOXB8 mRNA表达，以β-actin作为内参。扩增条件为：95℃ 5 min，循环1次；95℃ 3 s、60℃ 30 s，循环14次，99℃ 10 min，循环1次。实验重复3次，扩增结束后，根据2-ΔΔCt法计算miRNA与基因的相对表达量。使用的引物序列如下：miR-27b上游引物：5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′；下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCAGAATTTGCGT-3′；HOXB8上游引物：5′-ACACAGCTCTTCCCTGGAT-3′；下游引物：5′-CTTCTCCAGCTAAAGGGTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGATTTGGTGTCGTATTGGGC-3′，下游引物：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′；均交由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2双荧光素酶报告基因技术:通过生物信息学工具TargetScan7.2软件，预测miR-27b与HOXB8 3’-UTR结合的靶位点序列，设计并合成野生型(WT-HOXB8 3’-UTR)和突变型(MUT-HOXB8 3’-UTR)HOXB8的3’-UTR质粒载体。取对数生长期的胃癌细胞SGC-7901，调整密度以1×105个/孔接种于24孔板内，37℃、5%CO2恒温箱培养，使用 Lipofactamine 3000分别将miR-27b mimic或阴性对照(miR-27b NC)联合构建好的WT-HOXB8 3’-UTR质粒载体或MUT-HOXB8 3’-UTR质粒载体转染到SGC-7901细胞，置于培养箱培养24 h 后，PBS冲洗细胞，加入裂解液裂解细胞，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作，检测各组细胞荧光素酶活性。

1.3.3胃癌干细胞的分离、培养与鉴定:取培养于37℃、5%CO2恒温箱、对数生长期的SGC-7901细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以2000r/min离心5min，弃上清，加入含20 mg/L B27、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10 μg/L表皮细胞生长因子和20 μg/L白血病抑制因子的DMEM/F1培养液，制备细胞悬液，置于培养箱内继续培养，隔日半量换液，传代培养。取80 μL的细胞悬液，加入20 μL CD44+免疫磁珠混匀，置于4℃避光孵化30 min，离心弃上清，加入 Buffer溶液洗涤细胞，再将细胞重悬，严格按照试剂盒说明书操作，通过流式细胞仪分选CD44+标记的细胞。取分选后的细胞，按免疫荧光染色试剂盒说明流程操作，验证CD44+/EpCAM+双抗阳性表达，通过倒置荧光显微镜观察并拍摄图片。

1.3.4细胞转染:取生长状态良好的胃癌干细胞，调整密度以2×104个/孔接种于96孔板内，37℃、5%CO2恒温箱过夜培养。将细胞随机分为空白对照组、miR-27b NC组、miR-27b mimic组，将Lipofectamine 3000脂质体分别与miR-27b mimic以及对应的阴性对照(miR-27b NC)转染至胃癌干细胞，操作步骤按照试剂盒说明书进行，置于37℃、5%CO2恒温箱转染6 h，更换新鲜培养基，接着继续培养48h，收集细胞用于后续实验。为保证转染效果，转染每2d执行一次。

1.3.5Western Blot:收集转染后的3组胃癌干细胞，加入PBS清洗，使用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，置于冰上裂解，BCA法测定蛋白质含量。制备10% SDS-PAGE凝胶，取等量各组蛋白样品加样，通过电泳分离蛋白质，并电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉,室温封闭2h，TBST洗膜，加入稀释的兔抗人HOXB8(1∶500)一抗工作液，以鼠抗人GAPDH作为内参蛋白(1∶1000)，4℃孵育过夜。次日，弃一抗工作液，TBST洗膜后，加入对应的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(1∶5000)二抗工作液，室温孵育1h，TBST洗膜，利用ECL发光液显色3min，凝胶成像系统拍照，Image Pro-Plus系统分析各蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白的表达水平。

1.3.6CCK-8法:胃癌干细胞按照1.2.3方法转染后，置于37℃、5%CO2恒温箱内培养，分别于培养24、48、72 h，每孔细胞中加入10μL CCK-8试剂液，混合均匀，继续放在恒温箱培养2h，酶联免疫检测仪测定450nm处吸光度值。

1.3.7EdU染色:收集转染后的3组胃癌干细胞，调整密度按1×105个/孔接种在24孔板内，置于37℃、5% CO2恒温箱培养24h，再更换为终浓度10μmoL/L EdU的培养基培养，继续培养2h，弃去培养基，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛室温固定20min，弃固定液，甘氨酸孵育5min，PBS洗涤后，滴加0.5% Triton X-100透膜10min，PBS再次洗涤细胞，加入Apollo567荧光染料室温避光染色30min，清洗细胞后，通过Hoechst33342反应液室温避光孵育30min染核，PBS清洗细胞，封片，激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况，蓝色荧光为细胞核，红色荧光为EdU阳性细胞。

1.3.8细胞成球实验:收集转染后的3组胃癌干细胞，胰酶消化，离心，加入含生长因子的无血清培养基，吹打分散为单细胞悬浮液，调整细胞密度以1×103个/孔接种在96孔板内，置于37℃、CO2恒温中培养，1周后，倒置显微镜下观察细胞球形成情况，并测量球体直径。

1.3.9细胞克隆形成实验:收集转染后的3组CRC-CSCs细胞，离心并吹打分散为单细胞悬浮液，调整细胞密度以1×103个接种到无菌培养皿，轻晃培养皿，使细胞分散均匀，置于37℃、CO2恒温箱中培养，待培养14d后出现明显细胞集落，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定菌落，0.5%结晶紫染液染色15min，流水冲洗干净，干燥，光学显微镜观察并计数细胞克隆形成数目，将≥50个细胞聚集即为1个细胞菌落。

2 结 果

2.1胃癌组织及癌旁组织中miR-27b与HOXB8表达比较：miR-27b在胃癌组织中的相对表达量显著低于癌旁组织(t=36.768,P<0.001)，而HOXB8在胃癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织(t=41.649,P<0.001)，见图1。

图1 实时荧光定量PCR检测胃癌组织及癌旁组织中miR-27b与HOXB8表达

2.2miR-27b与HOXB8靶向关系验证：通过TargetScan7.2预测到miR-27b与HOXB8 3’-UTR在特定区域存在碱基互补现象，见图2A。双荧光素酶报告实验结果分析发现，miR-27b mimic和WT-HOXB8 3’-UTR重组质粒共转染组的相对荧光值较miR-27b NC和WT-HOXB8 3’-UTR重组质粒共转染组显著降低(t=23.165,P<0.001)，而miR-27b mimic和MUT-HOXB8 3’-UTR重组质粒共转染组与miR-27b NC和MUT-HOXB8 3’-UTR重组质粒共转染组的相对荧光值差异无统计学意义(t=0.569,P=0.278)，见图2B。

图2 miR-27b与HOXB8靶向关系验证

2.3胃癌干细胞的鉴定：流式细胞术检测分选前后胃癌干细胞比例，结果显示出在分选前与分选后CD44+标记的细胞亚群比例分别为1.34%、95.90%，可见分选后CD44+标记的细胞亚群比例明显增加(t=30.426,P<0.001)，参考相关文献[7]，说明分选到高纯度CD44+标记的胃癌干细胞，见图3。

图3 流式细胞术检测分选前后CD44+标记的细胞亚群比例

通过免疫荧光染色观察分选后细胞中CD44和EpCAM双抗体的表达，可见CD44显示绿色荧光，主要表达于细胞膜，EpCAM显示红色荧光，主要表达于细胞膜和细胞质，见图4。

图4 免疫荧光染色观察细胞中CD44和EpCAM

2.4转染后胃癌干细胞miR-27b与HOXB8表达检测：实时荧光定量PCR检测转染后胃癌干细胞中miR-27b表达，3组细胞间差异具有统计学意义(F=44.602，P<0.001)。与空白对照组比较，miR-27b mimic组细胞内miR-27b表达显著升高(P<0.01)，miR-27b NC组和空白对照组之间差异无统计学意义(P=0.375)，见图5A。Western Blot检测转染后胃癌干细胞中HOXB8表达，3组细胞间差异具有统计学意义(F=32.771，P<0.001)。与空白对照组比较，miR-27b mimic组细胞内HOXB8蛋白表达显著下降(P<0.01)，miR-27b NC组和空白对照组之间差异无统计学意义(P=0.413)，见图5B。

图5 转染后胃癌干细胞miR-27b与HOXB8表达比较

2.5miR-27b对胃癌干细胞活性影响：CCK-8检测各处理组胃癌干细胞的活性，在转染24、48、72h后，3组细胞间差异具有统计学意义(F24h=14.782,P<0.001;F48h=17.253,P<0.001;F72h=26.033，P<0.001)。与空白对照组比较，miR-27b mimic组细胞活性在各个时间点均显著下降(P均<0.05)，而在各时间点miR-27b NC组和空白对照组的差异均无统计学意义(P24h=0.321；P48h=0.513;P72h=0.428)，见图6。

图6 CCK-8检测各处理组胃癌干细胞活性

EdU染色结果如图7所示，可见空白对照组和miR-27b NC组有大量EdU标记的阳性细胞表达，而miR-27b mimic组中EdU标记的阳性细胞表达减少，3组细胞间EdU标记的阳性细胞数目差异具有统计学意义(F=37.581，P<0.001)。与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，miR-27b NC组和空白对照组之间则无统计学差异(P=0.118)。

图7 EdU染色检测各处理组胃癌干细胞增殖(×100)

2.6miR-27b对胃癌干细胞干性维持的影响：细胞成球实验结果如图8所示，通过倒置显微镜可观察到空白对照组胃癌干细胞有大量细胞成球，直径达到(515.46±40.48)μm，miR-27b NC组细胞也有大量细胞成球，直径为(542.82±43.41)μm，而miR-27b mimic组细胞成球个数较少，直径为(263.67±21.55)μm，球体积明显变小。

图8 细胞成球实验检测各处理组胃癌干细胞成球能力(左：×50；右：×200)

细胞克隆形成实验结果见图9，3组细胞间克隆数目差异具有统计学意义(F=36.903，<0.001)。与空白对照组比较，miR-27b mimic组胃癌干细胞克隆形成数目显著减少(P<0.01)，而miR-27b NC组较空白对照组的细胞克隆数目之间的差异无统计学意义(P=0.081)。

图9 细胞克隆形成实验检测各处理组胃癌干细胞克隆形成能力

3 讨 论

胃癌在全球范围内具有较高的发生率和死亡率，然而导致胃癌发生与转移的分子机制仍不完全清楚，存在于胃癌组织中的肿瘤干细胞具有很强的致瘤性，能够产生更多促进肿瘤生长的胃癌细胞亚群，是肿瘤转移和复发的关键因素，并且对化学治疗药物具有较强的抵抗力[2]。多项研究已表明，胃癌干细胞是负责启动胃癌复发、转移和肿瘤耐药的关键机制[8]，这为胃癌的诊治研究提供了新视角。

细胞表面标志物的表达检测是鉴定肿瘤干细胞的重要方法，目前，胃癌干细胞鉴定的几种表面标记物有CD133、CD44和醛脱氢酶1(ALDH1)。其中，CD44是具有多种生物学作用的跨膜糖蛋白，在肿瘤的侵袭和转移中起核心作用，以往研究结果表明，CD44+胃癌细胞比CD44-胃癌细胞显示出更强的成球能力和侵袭能力，CD44+胃癌细胞具有肿瘤干细胞特性，目前使用CD44+标记分选胃癌干细胞已在多项研究中运用[7,9]。同样，在本研究中通过CD44+标记磁珠分选法分选胃癌干细胞后，再次通过CD44和EpCAM双抗体进行鉴定，结果显示CD44+标记的细胞亚群比例高达95.90%，说明成功分选出胃癌干细胞。

胃癌的发生和发展是一个复杂的过程，miRNA可通过转录后调节癌基因或抑癌基因的表达影响胃癌细胞的生物学功能，包括致瘤性、侵袭性以及耐药性。miR-27b在多种癌症类型中起着复杂的作用，例如：Zhang等人[10]研究发现miR-27b在非小细胞肺癌中表达水平降低，通过靶向Snail1抑制肺癌的生长和上皮间质转化过程；Feng等[11]研究指出miR-27b在胃癌组织和胃癌细胞中表达水平均下调，且miR-27b在TNM分期较高、肿瘤组织较大的组织中表达更低。本研究结果同样显示，miR-27b在胃癌组织中表达降低，而在胃癌干细胞中转染mimic以过表达miR-27b后发现，肿瘤干细胞活性与增殖受到明显抑制，同时肿瘤干细胞的成球能力与克隆形成能力均下降，由此推测，miR-27b可能在胃癌进程中起着抑癌基因的作用。

HOX基因家族作为胚胎发育中的重要转录因子，在各种组织中差异表达。研究表明，该同源异形基因家族与多种癌症及相关疾病的发生发展均相关联。例如，HOXB8在结直肠癌组织中表达升高，而抑制HOXB8表达与结直肠癌细胞对化学疗法的敏感性增加有关[12]；HOXB8在人骨肉瘤组织和细胞系中均高度表达，敲低HOXB8可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤的肿瘤发生和转移[13]；在宫颈癌细胞中HOXB8作为miR-32-5p的下游调控靶标，降低HOXB8表达可抑制HeLa细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力[14]。目前已发现HOXB8通过诱导上皮间质转化来调节胃癌细胞的转移[15]，这一结果揭示沉默HOXB8可能与逆转胃癌细胞的恶性表型有关。但HOXB8在胃癌干细胞中的生物学功能尚不清楚。本研究发现HOXB8是miR-27b的直接靶基因，miR-27b可负调控HOXB8的表达，这表明了miR-27b可能通过直接调节HOXB8影响了胃癌干细胞的生物学特性。

综上所述，在胃癌组织中miR-27b低表达而HOXB8高表达，HOXB8是miR-27b的靶标基因，miR-27b通过调控HOXB8表达抑制胃癌干细胞活性与自我更新能力。本研究表明miR-27b可能为胃癌潜在的治疗靶点，为今后该疾病的诊治研究提供了新的切入点。