基于网络药理学和分子对接技术探讨三七治疗心房颤动的分子生物学机制

陶诗怡，于林童，朱春临，张 瑾，张兰鑫，黄 力

心房颤动是临床上最常见的持续性心律失常，是由心房肌纤维相互独立除极而导致的无序激动和无效收缩的房性节律，以心房基质重构和电重构为关键病理机制，其患病率随年龄增长而增加，可诱发栓塞、脑卒中等并发症，具有极高的致残率和致死率[1]。传统西医治疗以抗心律失常药物和电复律为主，但研究表明心房颤动复发率仍处于40%～50%的较高水平[2]，而中医药在防治心房颤动方面发挥了积极作用并展现出巨大潜力，因此，进一步挖掘中药抗心房颤动的分子机制不仅有利于研发新药新方，也有助于推动中医药现代化发展。中医古籍中无心房颤动病名的记载，根据临床表现可将其归属于“心悸”“怔忡”范畴，心脉瘀阻证是临床常见证型之一。三七是五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎，性温，味甘、微苦，归肝、胃经，具有散瘀止血、消肿定痛的功效[3]，现代药理研究证实三七具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、扩张血管、降低心肌耗氧量等作用[4]，但其治疗心房颤动的具体分子生物学机制尚未见明显立论。

网络药理学是基于系统生物学理论，利用生物网络数据库、生物网络构建方法和生物网络分析技术，通过构建“药物-靶点-疾病”复杂网络，从分子层面分析药物、靶点、疾病之间的内在联系，从而揭示其潜在机制的一门交叉学科[5]。故本研究立足于中药网络药理学，在现代研究充实的基础上对三七治疗心房颤动的分子机制进行预测和总结，以期为后续深入研究提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 三七活性成分、靶点收集及网络构建 以“三七”为关键词，通过检索中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集三七活性成分与作用靶点。根据药代动力学(ADME)属性值的推荐筛选标准，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选阈值[6-7]，获得可纳入研究的活性成分，并通过检索已发表文献对成分进行补充。利用PubChem数据库[8](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)对活性成分名称、结构式、分子式及CAS号进行校订确认，并借助Uniprot数据库[9](https://www.uniprot.org/)进行靶蛋白基因名的转换。通过Cystoscape 3.7.2软件构建三七活性成分-预测靶点网络。

1.2 心房颤动相关靶点预测 以“atrial fibrillation”为关键词，通过检索OMIM[10](https://www.omim.org/)、DrugBank[11](https://www.drugbank.ca/)、GeneCards[12](https://www.genecards.org/)、DisGeNET[13](https://www.disgenet.org/)数据库，采集心房颤动靶点信息，利用Draw Venn Diagram平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制药物-疾病靶点韦恩图，得到三七-心房颤动交集靶点。

1.3 交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及模块(module)提取 将交集靶点导入STRING数据库[14](https://string-db.org/)，设定物种为“Homo Sapiens”，最小互相作用大于0.4，隐藏游离节点，得到PPI网络，并通过Cytoscape 3.7.2软件对PPI网络进行可视化分析，设置连接度(degree)、综合得分(combined score)分别与节点大小及颜色深浅、边的粗细及颜色深浅成正比，进一步以degree的2倍中位数为筛选标准提取关键靶点。通过MCODE插件定位PPI网络中密度较高的区域(community/module)，得到具有生物学意义的潜在蛋白质复合体或功能模块[15]。

1.4 生物信息学基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 Metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html)拥有全面的基因注释功能并且每月更新数据资料[16]。将三七-心房颤动交集靶点导入Metascape平台，设定物种为“Homo Sapiens”，P<0.01，分析其生物学过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)及信号通路，利用Sangerbox平台(http://sangerbox.com/)对结果进行可视化处理。

1.5 活性成分-靶点-信号通路网络构建 基于主要活性成分、交集靶点及信号通路的筛选结果，通过Cytoscape 3.7.2软件构建三七活性成分-靶点-信号通路网络图，进而以degree、介数中心性(betweenness centrality，BC)及紧密中心性(closeness centrality，CC)大小作为参考依据，评估节点在全网络中的重要程度。

1.6 活性成分-靶点分子对接 分别通过PubChem数据库[8]和PDB数据库[17](https://www.rcsb.org/)收集活性成分3D结构和筛选主要靶点最佳蛋白晶体结构(有配体、结构相对完整)。利用AutoDock Tolls 1.5.6软件对蛋白进行去水、加氢，原子类型设为Assign AD4 type，运用Vina进行分子对接[18]，结合能(predicted binding affinity)越小则表明蛋白与配体对接活性越好，利用Pymol 2.3.0对结合能最低的前5种对接模式进行可视化处理。

2 结 果

2.1 三七活性成分预测靶点网络构建 通过TCMSP数据库共收集到三七活性成分119个，经ADME筛选后得到有效成分8个，同时查阅文献发现三七皂苷r1[19]亦是三七重要活性成分，因此，共筛选出三七有效成分9个(见表1)，靶点253个，剔重后得到预测靶点188个。通过UniPort数据库检索后得到251个已验证性人源靶基因，剔重后得到有效靶基因186个，构建三七活性成分-预测靶点网络，共包含196个节点、260条边(见图1)。

表1 三七活性成分信息

图1 三七活性成分-预测靶点网络

2.2 交集靶点PPI网络构建及模块提取 从GeneCards数据库收集心房颤动靶点2 830个，筛选出Relevance score大于中位数(2.09)的靶点1 416个，分别从OMIM、DrugBank、DisGeNET数据库收集得到心房颤动靶点110个、135个、287个，所有数据库结果去重后共得到心房颤动相关靶点1 638个，韦恩图示三七-心房颤动交集靶点共102个(见图2)。通过Cytoscape 3.7.2软件获取degree大于中位数(32)的交集靶点PPI网络，包含52个节点、1 019条边(见图3)，进而以degree大于2倍中位数(64)为筛选标准，提取出7个关键靶点(见表2)。通过MCODE插件分子复合物检测算法对PPI网络进行分析，获得2类模块(见图4)。

图2 三七成分-心房颤动靶点韦恩图

图3 三七-心房颤动交集靶点PPI网络

表2 三七-心房颤动交集靶点PPI网络关键靶点拓扑结构参数

图4 三七-心房颤动交集靶点PPI网络中的模块

2.3 生物信息学GO分析及KEGG通路富集分析 利用Metascape平台对102个交集靶点进行基因注释，得到显著相关生物学过程6个、分子功能4种及细胞组分表达过程4条。结果提示，三七主要参与的生物学过程包括细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、活性氧代谢过程、凋亡信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应的调控、对生长因子的反应等，相关靶点治疗心房颤动的功能主要富集于细胞因子活性、蛋白激酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、内肽酶活性等(见图5)。KEGG通路富集分析显示，主要涉及晚期糖基化产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、MAPK信号通路、白细胞介素(IL)17信号通路等(见图6)。三七治疗心房颤动靶点通路富集结果详见表3。

图5 三七-心房颤动交集靶点GO生物功能富集分析

图6 三七-心房颤动交集靶点KEGG通路富集分析

表3 三七-心房颤动交集靶点通路富集结果

2.4 活性成分-靶点-信号通路网络构建 通过Cytoscape 3.7.2软件构建三七活性成分-靶点-信号通路网络，共包括129个节点、408条边(见图7)。通过Network Analyzer分析网络拓扑结构参数，结果显示，槲皮素degree为88，BC为0.66，CC为0.70(见表4)，MAPK1 degree为16，BC为0.04，CC为0.48(见表5)，预测槲皮素与MAPK1在三七活性成分-靶点-信号通路网络是较关键的成分与靶点。

图7 三七活性成分-靶点-信号通路网络图

表4 三七活性成分-靶点-信号通路网络中活性成分拓扑结构参数

表5 三七活性成分-靶点-信号通路网络中主要靶点拓扑结构参数

2.5 活性成分-靶点分子对接 选择三七-心房颤动交集靶点PPI网络与活性成分-靶点-信号通路网络中的14个主要靶点TNF、IL-6、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)、半胱天冬酶3(CASP3)、Akt1、MAPK1、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤蛋白P53(TP53)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(RAF1)、表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶Cα(PRKCA)、蛋白激酶Cβ(PRKCB)和三七9个活性成分进行分子对接。按结合能从低到高排序，其中，结合能最低的是BCL-2与β-sitosterol，其次为TNF与Ginsenoside rh2，PTGS2与Quercetin(见表6)，对结合能最低的前5种对接模式进行可视化处理(见图8)。

表6 三七主要活性成分-关键靶点分子对接结果(前12位)

图8 三七活性成分与主要靶点分子对接Vina得分最低的前5种对接模式

3 讨 论

本研究共筛选出三七活性成分9个，心房颤动相关的三七靶点102个，显著相关生物学过程6个、分子功能4种及细胞组分表达过程4条，显著相关信号通路20条，14个主要靶点与配体分子对接结果得分均小于-6.0，体现出三七活性成分和靶标之间具有良好的结合活性。

本研究结果可知，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷rh2在三七治疗心房颤动作用机制中占有重要地位，预测三七主要通过此4种成分达到治疗心房颤动的目的。交集靶点PPI网络结果显示，三七治疗心房颤动的102个靶点间连线紧密，说明靶点间互相关联而非独立存在，体现出其作用机制的复杂性与相互性。MCODE分析提取出两个模块(见图4)：F2-CAV1-IGF2-HSPA5-IL1A-RAF1-CXCL2-HSPB1-IGFBP3-NFKBIA-CD40LG-F3-SOD1与CYP1B1-CYP1A2-NR1I2，提示这些靶点间连线密度较高，常作为多个蛋白质共同组成复合体而发挥生物学作用或为功能模块，相互作用更加密切。KEGG通路分析提示，三七主要通过调控AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等而发挥抗心房颤动的作用。

研究证实，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇可通过下调IL-6、TNF-α水平改善心肌炎症反应[20-23]。IL-6、TNF-α是重要的炎性因子，通过参与心房的电重构、结构重构与血栓形成而使心房颤动持续存在，TNF-α主要受核转录因子-κB(NF-κB)信号调节，通过下调T型钙通道表达、抑制T型钙通道功能，改变连接蛋白的表达，干扰电生理及直接改变心肌细胞中Ca2+的处理为心房颤动起始提供底物，促进电重构[24]，从而促进心房颤动的发展和维持，通过抑制NF-κB/TNF-α信号传导途径并降低促炎性细胞因子，有助于改善心房颤动易感性[25]。此外，IL-6可加速内皮细胞活化与损伤，其与白细胞、血小板之间的相互作用可致高凝状态的形成，最终引起血栓形成[26]，并且IL-6对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)具有极强的激活作用，而MAPK信号通路的激活亦可促进心肌纤维化，加速基质重构[27-28]。同时，IL-6、TNF-α可诱导转化生长因子-β1(TGF-β1)与受体结合、诱导氧化应激及内皮素-1(ET-1)等促纤维化因子表达而加剧心肌纤维化进程[29]。此外，AGE-RAGE信号通路在血管内皮损伤介导的心房颤动中亦具有重要作用，研究表明，AGE与RAGE结合可增加内皮层通透性、增加血栓形成机会及降低血管舒张性，从而促进炎症和纤维化反应[30]，心房颤动病人的AGE和可溶性晚期糖基化终产物受体(sRAGE)血浆水平较高，并与心房大小呈正相关[31]，并且大量AGE和RAGE的相互作用可增强结缔组织生长因子(CTGF)表达，进一步促进心房纤维化[32]，预测三七可能通过抑制IL-6、TNF-α及AGEs-RAGE轴从而抑制心房纤维化进程。

槲皮素亦可通过调控PI3K/Akt信号通路来减轻炎症[33]，PI3K属于心脏保护蛋白，可抑制G蛋白偶联受体下游的病理信号传导级联，Akt激活依赖PI3K途径并且为通路关键节点，PI3K/Akt可协同缺氧诱导因子1(HIF-1)上调以预防体内外缺血再灌注诱导的细胞凋亡，并可通过参与重建细胞代谢途径实现心脑保护作用，抑制心脏PI3K-Akt信号传导可增加发生心房颤动的风险[34-35]。此外，Li等[36]研究表明，心房颤动病人中PI3K上调，通过PI3K/Akt/p300轴可调节心脏成肌细胞功能以适应血流动力学变化，从而降低心房颤动发生率及改善病人预后。Chong等[37-38]研究证实PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路激活可减少左心房纤维化并调节离子通道变化，促进K+外流，从而降低心房颤动敏感性。Marín-Aguilar等[39]研究显示PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路抑制可促进细胞自噬，消除累积细胞含量，从而改善心脏功能。

研究表明，心房颤动消退后，心房电生理重塑可在几天之内恢复，但结构损伤修复需要更长时间，甚至部分损伤永远无法复原，心房颤动发生后肌细胞凋亡带来的损伤是心肌修复的重大挑战[40]。β-谷甾醇和豆甾醇在抗心肌凋亡过程中具有重要作用，主要通过上调Bcl-2/Bax以抑制心肌细胞凋亡及纤维化[21，23]。Bcl-2是抗细胞凋亡的关键基因，研究证实Bcl-2可通过保护线粒体内膜以减少细胞色素C(Cyt C)释放、抑制超氧阴离子的产生从而抑制细胞凋亡[39]，并能将细胞维持在低代谢状态来调节心肌细胞的新陈代谢，从而大大增强心肌细胞对细胞损伤的耐受力[41]。此外，CASP3是促凋亡的重要基因，是凋亡过程的关键下游酶，可直接裂解凋亡底物。Liang等[23]研究显示，豆甾醇可下调CASP3表达从而抑制细胞凋亡过程；Trappe等[42]亦证实敲低CASP3基因后可减少细胞凋亡和预防房内传导延迟从而抑制或减缓持续性心房颤动的发作，故推测三七可通过上调Bcl-2或下调CASP3水平以抑制细胞凋亡从而达到治疗心房颤动的目的。

本研究运用网络药理学和分子对接技术探索了三七抗心房颤动的分子机制，其作用涉及细胞、组织、器官、代谢、免疫、炎症、凋亡、氧化应激、离子通道等多个方面，并与细胞因子、凋亡基因家族、蛋白激酶家族、激素等物质密切相关，体现出中药可通过多成分、多靶点、多通路治疗疾病的特点。但由于数据交互分析的误差及局限性，部分结果暂未有足够文献支持，以期能为后续开展三七治疗心房颤动的相关研究提供新视角与新思路。