视网膜母细胞瘤免疫治疗研究进展△

王润泽 王建文

视网膜母细胞瘤(RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，全球发病率约为1/15 000[1]，对全世界婴幼儿的视力甚至生命均造成极大的威胁。目前化学治疗是RB的一线治疗方法，通过药物摧毁快速分裂的癌细胞从而治疗RB。然而，由于缺乏特异性，化学治疗易产生骨髓抑制、中性粒细胞减少、感染、贫血和听力下降等严重的副作用[2]，且长期化学治疗会导致多种药物耐药性的产生，会使得肿瘤更大概率地发生转移，增加复发的可能[3]。因此目前迫切需要一种新的RB治疗方式，在使肿瘤生长速度显著下降的同时，能降低对机

体的副作用，并具备对患者肿瘤复发和转移的长期抑制作用[4]。近年来，免疫治疗作为一种新的治疗策略，广泛地应用于各种肿瘤的治疗[5]。此疗法不仅可以减轻肿瘤患者负担，还可以作为辅助治疗方式，有效地清除残留的肿瘤细胞[6]；既能治疗目前处于活跃期的肿瘤，又能预防肿瘤复发[7]。目前，免疫治疗受到了越来越多的关注，许多免疫治疗方法也正逐渐被开发并用于治疗RB。

1 免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂是针对相应免疫检查点研发出的一系列药物，其主要作用为通过细胞毒性T细胞介导的免疫监视，加速肿瘤微环境的抗肿瘤功能，切断肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，使得肿瘤细胞对免疫细胞的抑制程度大幅度降低，进而治疗癌症的一种治疗手段[8]。大量针对免疫检查点的研究，如程序性细胞死亡1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)以及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)等都展示了治疗晚期肿瘤的良好前景和显著的抗肿瘤功效[5]。目前针对PD-1及其配体PD-L1介导的治疗，已被批准用于治疗黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、淋巴瘤等多种肿瘤。PD-1在树突状细胞递呈自身抗原的过程中可以通过减弱自身反应性T细胞来发挥其作用，还可以抑制自身反应性T细胞对抗非造血组织的功能，通过抑制组织反应性T细胞和保护免疫介导的组织损伤，从而介导组织耐受[9]。除了介导T细胞固有的抑制作用外，PD-1还能通过促进诱导性调节性T细胞的诱导和维持抑制T细胞反应。与维持T细胞稳态的重要作用相反，PD-1与恶性肿瘤上表达的PD-L1连接后可介导有效的抑制信号，阻止效应T细胞的扩张，从而对肿瘤特异性免疫产生有害影响[10]。研究表明，在原发性RB中PD-L1表达明显升高，PD-1表达明显降低，且在化学治疗后的RB中同时表达PD-1和CTLA-4 蛋白的患者的总生存率明显低于非表达者[5]。这表明免疫检查点抑制剂对于治疗RB应具有良好的效果。

2 过继免疫疗法

过继免疫疗法是在体外培养抗肿瘤淋巴细胞或外周血单核细胞等一系列对肿瘤敏感的高度个性化的免疫细胞，增殖到一定数量后将这些细胞重新注射到患者体内，通过此类细胞能特异性识别肿瘤相关抗原的特点，进而介导肿瘤消退的一种治疗方式[11]。这是一种高度个性化的肿瘤治疗方法，每个患者直接接受抗癌免疫细胞，使得机体的抗原特异性免疫能力增强。对于早期患者来说，患者免疫状态相对良好，术后应用过继免疫疗法可以彻底清除残留肿瘤细胞，延长生存期。对于晚期患者来说，将过继免疫治疗与其他治疗方式联合使用可提高免疫状态，能在减轻肿瘤负荷后有效杀伤残留的肿瘤细胞[12]。目前用于过继免疫治疗的T细胞主要有两种来源:肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和基因工程T细胞。在基于TIL的治疗中，首先从患者的肿瘤中分离出TIL，然后将其装载到肿瘤相关抗原的抗原提呈细胞中重新刺激，最后将扩增的TIL重新注入患者体内以攻击肿瘤细胞[13]。以基因工程T细胞为基础的治疗，首先通过白细胞分离从患者体内分离出T细胞，然后激活改造T细胞，使其表达特异性识别肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体，并将其扩大到相应临床治疗数量，重新注入患者体内[14]。过继免疫疗法对治疗许多肿瘤，如黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、白血病，是非常有效的。然而，目前的细胞培养技术生产T细胞的成本非常高。因此，过继免疫治疗的广泛应用迫切需要能够显著降低制造成本并提高制造能力的新型细胞培养技术[14]。目前有研究表明，在体外临床预测试中，CD171和GD2是CAR-T细胞治疗RB的有效靶点，对CD171和GD2具有特异性的CAR-T细胞能够有效靶向RB细胞，杀死原发肿瘤和转移的肿瘤细胞，并降低化学治疗相关的晚期副作用，从而改善目前对转移性RB有限的治疗策略[15]。

3 细胞周期蛋白依赖激酶4/6抑制剂

细胞周期蛋白D-细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)4/6-INK4-RB通路的失调是抗激素替代治疗的重要因素[16]。细胞在细胞周期中过度生长是癌症的基本特征。细胞周期蛋白和CDK能够推动细胞周期从G1期向S期和G2期向M期发展。其中CDK4和CDK6对于正常细胞的细胞周期来说虽不是必需的，但对推动各种类型癌症的细胞周期进程是必不可少的[17]。CDK4/6抑制剂是指一类针对恶性细胞失控调节细胞周期的药物，它们通过降低RB蛋白磷酸化和诱导细胞周期停滞在G1/S期转变，将可逆性细胞停滞转化为不可逆的生长停滞，从而抑制肿瘤生长，导致细胞死亡[18]。CDK4/6抑制剂不仅能诱导肿瘤细胞周期阻滞，而且能诱导抗肿瘤免疫应答，增强肿瘤细胞的抗原呈递，刺激效应T淋巴细胞活化和减少免疫抑制性T细胞的增殖[19]。CDK4/6抑制剂增强抗肿瘤免疫反应表现在两个方面：首先，CDK4/6抑制剂能够激活肿瘤细胞内源性逆转录病毒元件的表达，从而增加细胞内双链RNA的水平，反过来又刺激了III型干扰素的产生，从而增强肿瘤抗原的提呈；其次，CDK4/6抑制剂显著抑制了调节性T细胞的增殖。最终，这些事件促进细胞毒性T细胞介导的肿瘤细胞清除[20]。高选择性口服CDK4/6抑制剂帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)和阿贝西利(abemaciclib)能够明显抑制RB阳性肿瘤细胞的增殖，并在雌激素受体阳性乳腺癌模型中显示出剂量依赖性的生长抑制作用，目前已经获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准并应用于雌激素受体阳性、人表皮生长因子受体阴性的晚期乳腺癌患者的治疗[21]。研究表明，三叶因子1(TFF1)高表达的RB细胞株能够选择性下调CDK6，外源给药TFF1可降低两种RB细胞系(Y-79与WERI-Rb1)的生存能力，所以在RB患者中应用CDK4/6抑制剂是一种很有前途的限制细胞增殖和肿瘤生长的策略[22]。

4 抗血管内皮生长因子药物

众所周知，细胞的生长与血液的供应密切相关，异常血管的出现会给肿瘤细胞提供更有利的生存环境，促进肿瘤细胞的生长。血管内皮生长因子(VEGF)由于其促进血管生成的功能经常成为治疗癌症的分子靶标。VEGF在RB组织中存在过度表达的情况，且分化不良的RB中VEGF的表达高于分化良好的RB中。因此，VEGF可能是RB的潜在治疗靶标[23]。VEGF不仅参与生理性血管生成，同时也是与肿瘤血管生成相关的重要生长因子之一，通过促进血管生成和血管通透性以及调节肿瘤免疫微环境在肿瘤发生发展中起着关键的作用，被认为是促进肿瘤发生发展的关键因素之一[24]。抗VEGF治疗的作用机制是多因素的，包括抑制血管生成、诱导上皮细胞凋亡、直接作用于表达VEGF受体的肿瘤细胞、通过增强细胞毒性T细胞和树突状细胞活性来调节免疫系统，以及减少免疫抑制性T调节细胞、肿瘤相关巨噬细胞和髓源性抑制细胞的活性和积聚来发挥作用[25]。抗VEGF药物也存在着部分缺陷，包括不断发展的耐药性以及缺少确定可靠的生物标记物来预测癌症患者的治疗效果，因此针对此方面的抗VEGF药物研发应该成为目前研究的重点[26]。目前抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗已用于治疗非小细胞肺癌和结肠癌，该抗体还应用于异种移植小鼠的RB治疗，结果表明该药物能明显降低微血管密度并抑制RB细胞的生长[23]，也进一步证实了VEGF过度表达与中国人群RB的风险增加有关，应用抗VEGF药物治疗RB这一策略是可行的。

5 溶瘤病毒

虽然目前免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞治疗方法已经在多种癌症治疗中显示出巨大的成功，但由于肿瘤具有免疫失调这样一个重要特征，能够逃避由于树突状细胞功能受损和辅助性T淋巴细胞1反应而产生的免疫监视，所以上述疗法仍不是特别完善。溶瘤病毒是一种具有复制能力的病毒，在保留正常细胞和组织的同时，能够选择性地感染和杀死体内外的肿瘤细胞，增强肿瘤的免疫原性并诱导抗肿瘤免疫反应，有效对抗肿瘤免疫失调[27]。由于病毒复制是针对肿瘤细胞的，局部病毒颗粒浓度的自然增加会导致病毒颗粒在整个肿瘤中传播。这可能使相对低的、无毒的剂量在消除整个肿瘤方面非常有效[4]。自早期首次描述腺病毒以来，由于其在体内显著的转导效率、易于制备、易于使用、具有良好的安全性等优点，腺病毒一直被广泛研究[28]。改变细胞特异性、传染性，改变组织特异性复制机制的能力，以及改变病毒与细胞检查点调节器的相互作用，正在成为设计更安全、更有效的腺病毒的新趋势。溶瘤腺病毒的治疗效果取决于给药途径。肿瘤内给药是目前最常见的给药方式。这种方式增加了靶向性和肿瘤细胞感染其他细胞的机会，与静脉、动脉或腹腔注射相比，所需的腺病毒也更少。虽然肿瘤内注射是局部实体瘤的理想选择，但对于转移性肿瘤仍需全身注射。溶瘤腺病毒也可以与主流癌症治疗方法(如化学治疗和放射治疗)相整合，并能产生更加显著的治疗效果，比接受单一疗法的动物具有更长的无瘤期和生存期。这也能表明，病毒的溶瘤作用和化学治疗、放射治疗的细胞毒性效应之间存在协同作用，这种协同作用的可能性是由于化学治疗、放射治疗对免疫系统产生免疫抑制，从而使得机体允许腺病毒在宿主中复制所产生的作用[28]。目前溶瘤腺病毒和复制缺陷腺病毒的联合治疗在原位RB小鼠模型中显示了良好的溶瘤作用，为此疗法的应用提供了一定的理论依据[4]。

6 免疫治疗相关的疫苗

疫苗疗法是最具成本效益且影响最大的医疗干预措施之一[26]，通过给患者注射可以刺激免疫系统的抗原，扩增原始的T细胞库中肿瘤反应性T细胞池，重新激活现有的肿瘤特异性T细胞，增加肿瘤反应性T细胞反应的广度和多样性，从而起到治疗的效果[29]。疫苗疗法重新激活了患者被抑制和削弱的免疫系统，将免疫抑制转换到免疫激活，增加了抗肿瘤免疫细胞的数量。它依赖于患者免疫系统从长期免疫抑制中恢复的能力，通过诱导有效的免疫反应来对抗恶性肿瘤，通过封锁肿瘤微环境中的免疫抑制起到抗癌作用[23]。治疗性DNA癌症疫苗现在被认为是激活免疫系统对抗癌症的一个非常有前途的策略，目前使用质粒DNA疫苗进行的几项临床试验均显示出良好的安全性和广泛且特异的免疫应答激活能力[30]。DNA疫苗技术的最新进展使得DNA疫苗成为免疫靶向方法的重要补充或替代，因为它能够引发对多个部位的免疫而非依靠单个多价结合位点，不受特定HLA类型的限制，不整合到宿主DNA中，可以在没有抗载体免疫的情况下得到增强，在人群中具有良好的耐受性，稳定且具有成本效益等优点[31]。为了提高疫苗诱导的免疫应答和治疗效果，可以采用两种不同的策略来改进DNA疫苗。第一种方法是通过选择和优化插入质粒DNA的最佳抗原来提高其免疫原性，第二种策略是将DNA疫苗与其他辅助疗法相结合，通过减弱肿瘤微环境中的免疫抑制或通过增加免疫细胞的活性和数量来提高其活性[30]。越来越多的临床前和临床研究正在采用这两种策略，以便更好地开发DNA疫苗的潜力。雷妥莫单抗(Racotumomab)是一种靶向糖基GM3的抗个体基因型疫苗，对于神经母细胞瘤和RB的疗效在目前的临床试验中进行了测试，显示此疫苗在0.4 mg剂量下具有良好的治疗效果，大多数患者都会引起相应的免疫应答反应[32]，为免疫相关疫苗治疗RB提供了新的证据。

与一般的癌症治疗方式相比，免疫治疗不具备其他常规治疗方法的缺点，更具有特异性，能使组织的损伤达到最小化，防止癌症复发，在不损害血-脑屏障的情况下有效治疗癌症[11]。免疫抑制检查点抑制剂和其他形式的免疫治疗在许多患者，包括转移性癌症患者，治疗与生存方面均取得了显著的进展。随着新的免疫疗法和免疫疗法组合的发展，了解抗肿瘤免疫反应的不同方面，如肿瘤如何被T细胞识别，可能会对RB的免疫治疗产生新的认识和新的治疗手段[33]。