CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎症信号通路在糖尿病视网膜病变中的作用研究进展△

孔慧 崔彦

糖尿病视网膜病变(DR)是最常见的糖尿病特异性并发症之一，也是成年人低视力和致盲的主要原因。目前治疗DR的方法主要有视网膜激光光凝、玻璃体内注药和玻璃体切割术等。然而，这些治疗方法并不能完全控制DR病情，因此探讨早期 DR的有效预防措施具有重要意义。越来越多的研究认为，炎症和免疫系统失调是DR发生发展的关键因素[1-2]。近年来随着视网膜神经血管单元(RNVU)[3]的提出，人们认为糖尿病代谢改变引起的炎症反应不仅损伤视网膜的微血管，而且会损伤神经血管单元，导致逐渐发生进行性的神经病变[4-5]。CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎症信号通路参与RNVU中细胞间信

号传递，放大炎症反应，诱导视网膜内皮细胞程序性死亡，是毛细血管退化和视网膜缺血发展的关键。本文对近年来DR炎症机制的研究进展以及CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎症信号通路在DR中的作用进行综述。

1 炎症与DR的关系

炎症与DR的关系是1993年由Tang等[6]首先报道的，他们发现DR患者玻璃体中的免疫细胞增多且细胞因子表达水平升高。Powell 等[7]对类风湿关节炎的糖尿病患者使用水杨酸治疗时，发现DR发病率低于预期，提示DR与炎症反应有关。在对糖尿病动物和患者的大量研究中发现，实验对象的视网膜或玻璃体液均会发生与炎症反应一致的各种生理和分子异常[8-9]。Idit 等[10]采用前瞻性研究设计研究发现，增生型DR患者视网膜出现与炎症高度相关的凝血因子，且患者视网膜组织血管生成因子活性升高，进一步证实DR的发病机制与炎症和免疫系统失调相关。

1.1 DR中的炎症反应炎症是由宿主免疫系统介导的防御过程，是机体重要的生理过程。视网膜组织有高度敏感的免疫系统[11]。这些免疫通路失去调控，就会对周围宿主组织构成威胁，发生炎症反应。在急性血糖升高时，宿主外周血肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6 和IL-18等细胞因子的含量升高[12]，中性粒细胞数量也升高[13]。非增生型DR患者的眼部组织中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等多种炎症因子含量升高，其中IL-8和TNF-α的水平甚至高于活跃的增生型DR患者[14]。有人采用玻璃体氧化诱导视网膜病变大鼠模型模拟增生型DR病程，模型大鼠NF-κβ基因以及IL- 6和TNF-α的蛋白表达显著增加[15]，说明在DR早期、非增生期及新生血管期各个阶段都有炎症反应。

持续或低强度的刺激使靶组织处于长期或过度炎症反应时，可导致机体处于非可控性炎症状态[16]。糖尿病时宿主体内代谢异常导致胶质细胞活化，长期的组织应激促使视网膜小胶质细胞变得反应过度，并促进炎症因子分泌。而Müller细胞通过CD40-ATP-P2X7途径协调视网膜小胶质细胞诱导促炎反应，造成RNVU的炎症级联反应，形成慢性炎症性视网膜环境，进一步引起视网膜内皮细胞死亡，毛细血管变性[17]。DR时视网膜小胶质细胞炎症因子的分泌会导致其他胶质细胞的激活，如星形胶质细胞，放大视网膜中的炎症反应，形成恶性循环，导致不可控性的慢性低度炎症反应。

1.2 糖尿病引起视网膜炎症的因素高糖、嘌呤产物、高血脂、高眼压、氧化应激、血管内皮生长因子、晚期糖基化终末产物、循环系统内或玻璃体内高水平的细胞因子和趋化因子、氧自由基、细胞凋亡碎片以及糖尿病本身的免疫损伤都与DR时炎症激活有关[18-19]。高血糖本身是一种促炎环境[20]，高糖可上调大鼠视网膜小胶质细胞TNF-α和趋化因子CCL2的表达[21]。小胶质细胞是视网膜的常驻免疫细胞[22]，是许多生长因子和炎症因子的重要来源，激活后产生大量的炎症因子，并迁移至外层视网膜。持续的高血糖导致小胶质细胞过度分泌大量的促炎症因子，导致慢性炎症、血-视网膜屏障损伤和DR的病理恶化，抑制视网膜小胶质细胞活化能选择性地减轻糖尿病视网膜炎症反应[23]。

ATP是机体的重要代谢产物。大多数哺乳动物细胞的细胞质中含有高达5～10 mmol·L-1ATP。基础代谢条件下ATP在细胞外以非常低的浓度存在，细胞损伤和死亡后以高浓度释放。细胞外ATP作为一种内源性危险信号，参与体内多种炎症反应，在炎症细胞的趋化、吞噬和分泌等过程中发挥重要的调控作用[24]，包括肺部炎症和纤维化、全身炎症和内毒素血症过程中的组织损伤。Costa等[25]采用体外培养的视网膜细胞发现，高糖通过增加ATP的胞外释放和减少降解，改变了视网膜中的嘌呤能信号系统。由此产生的高水平的细胞外ATP可能导致炎症参与DR的发病过程。

2 CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎症信号通路参与神经血管单元细胞间信号串扰

神经血管单元(neurovascular unit)是用于血-脑屏障的术语，Eric将这个概念应用于视网膜，指神经元、胶质细胞和血管之间复杂的功能耦合，视网膜微血管与神经元及胶质细胞紧密关联，组成RNVU。这些细胞密切协调，整合视网膜血管中血液流动与代谢活动，在DR的临床特征出现之前，就已出现这些受损的生理反应[26]。神经元、血管细胞、胶质细胞和局部免疫细胞之间相互作用的破坏，与早期DR的进展有关。因此，制定新的治疗策略来预防或逆转视网膜神经退行性病变、神经炎症和受损的细胞间相互作用是有意义的[27]。Müller细胞通过P2X7激活介导TNF-α和IL-1β分泌的CD40-ATP-P2X7通路，参与RNVU炎症反应中细胞间信号串扰(cell to cell cross-call)，对此通路各靶点以及上下游信号分子的抑制有助于减轻DR中的炎症反应，进一步控制DR的早期病变。

2.1 CD40/CD40L轴CD40是TNF受体超家族的成员，CD40-CD40L通路是自身免疫和适应性免疫的核心。糖尿病小鼠视网膜CD40基因及蛋白表达均上调[28]。糖尿病患者外周血中可溶性CD40受体sCD40L水平升高[29]。sCD40L的水平与DR的严重程度呈正相关，可以预测DR的严重程度[30]。CD40对于DR中的炎症反应至关重要。

CD40在视网膜Müller细胞、内皮细胞、小胶质细胞和神经节神经元中具有低水平的基础表达。高糖状态下细胞表面过表达CD40，从而引起炎症反应，Müller细胞上CD40与配体结合后通过释放ATP和上调P2X7双重机制诱导视网膜内皮细胞程序性死亡，这可能是DR血管损伤的重要因素[17]。CD40缺陷小鼠表现出与DR相关的炎症反应减弱[31]。CD40-/-的糖尿病小鼠视网膜内皮细胞不会发生细胞间黏附分子-1、TNF-α、IL-1β、趋化因子CCL2 mRNA表达上调，白细胞黏附以及毛细血管变性[17,31]。

2.2 ATP和嘌呤能信号通路ATP是生理状态下维持细胞代谢功能的主要能量物质，在应激状态下可作为损伤信号分子被释放到细胞外调控多种细胞效应[32]。DR患者视网膜胶质细胞通过释放ATP 介导嘌呤信号能受体激活一系列下游信号引起炎症反应[31]。ATP既可以在细胞损伤及死亡后释放，也可以通过不同的通道从活细胞中释放，如连接蛋白、半通道蛋白或特定的膜转运蛋白通道。几乎所有细胞在特定的刺激下均可释放ATP至胞外[33]。

嘌呤能信号参与介导视网膜的损伤及变性，在缺血缺氧、高眼压和糖尿病等致病条件下，CD40通路被激活，释放ATP作为一种内部危险信号，激活视网膜胶质细胞嘌呤能受体P2X7，促进炎症反应以及视网膜血管内皮细胞的程序性死亡。嘌呤能受体包括P1型和P2型。其中P1受体是腺苷受体，P2受体优先被ATP和ADP激活。P2受体又分为两个不同的亚家族：配体门控离子通道型受体P2X和G蛋白偶联受体P2Y。P2X受体是由7种不同亚型组成，命名为P2X1、2、3、4、5、6、7。P2Y受体由8种不同亚型组成，命名为P2Y1、2、4、6、11、12、13、14[34]。其中P2X7是目前研究最多的受体[35]。

2.3 P2X7受体P2X7受体在视网膜多种类型的细胞上表达,包括神经细胞(如神经节细胞、神经胶质细胞和视网膜血管内皮细胞等)。在ATP短暂刺激下，P2X7受体阳离子通道打开,导致K+外流以及Na+、Ca2+内流。在ATP 持续刺激下，P2X7受体会形成非选择性膜孔，允许一些相对分子质量达 9×106的物质进入细胞内，导致细胞死亡[36]。由ATP过度激活P2X7受体触发的钙信号失调是诱导神经元和微血管细胞死亡的关键步骤[37]，P2X7信号也能通过激活K+和Ca2+通道放大高糖诱导的炎症反应[38]。依赖P2X7的细胞因子表达升高会促进DR的发生与发展[39]。激活P2X7受体会导致视网膜周细胞释放IL-1β，进一步促进周细胞丢失，而损害血-视网膜屏障的完整性，导致血管渗漏和黄斑水肿[40]。P2X7受体被认为是多种眼部疾病的潜在药理学靶点，通过调节跨内皮电阻和细胞间连接在维护血-视网膜屏障的完整性中发挥重要作用[41]。P2X7受体拮抗剂可以阻止视网膜微血管中由于P2X7激活而引起的细胞线粒体功能的改变和细胞通透性的改变，在治疗DR中发挥作用[42]。

P2X7受体是ATP刺激视网膜小胶质细胞活化并分泌IL-1β和TNF-α的关键[38,42]。药物途径阻断P2X7受体，敲除P2X7或使用巨噬细胞P2X7-/-小鼠，可使视网膜TNF-α和IL-1β表达下调，视网膜内皮细胞凋亡减少[39]。目前，正在进行I期/Ⅱ期选择性P2X7受体拮抗剂的临床试验评估[43]。P2X7受体抑制剂JNJ47965567能有效降低高糖对人周细胞的损伤作用[37]，对糖尿病大鼠腹腔注射小分子P2X7受体抑制剂A740003和AZ10606120，对血糖无影响，但可以完全逆转视网膜血管通透性增加、VEGF积聚和IL-6高表达。核苷逆转录酶抑制剂拉米夫定，是一种新发现的P2X7受体抑制剂，可以减弱DR小鼠神经元和血管病变的进展，用拉米夫定治疗后糖尿病小鼠视网膜中的无细胞毛细血管数量减少[44]。

2.4 P2X7/NLRP3受体P2X7受体是阳离子门控通道，可允许K+、Na+、Ca2+等离子通过,而细胞内K+外流又是NLRP3、caspase-1激活以及前体和成熟巨噬细胞中IL-1β释放的关键信号通路[45]。功能性NLRP3炎性小体的关键成分是NLRP3、适配器蛋白ASC和caspase-1。细胞发生应激后，NLRP3招募ASC和pro-caspase-1，导致caspase-1激活并促进细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和分泌。细胞外ATP激活P2X7/NLRP3炎症信号通路参与非酒精性脂肪性肝病理过程[35]。在中枢和脊髓神经系统小胶质细胞介导的神经炎症中P2X7/NLRP3炎症信号通路也起着至关重要的作用[46-47]。慢性高眼压时视网膜小胶质细胞中P2XR/NLRP3通路的激活可导致视网膜神经节细胞死亡[48]。

P2X7受体和NLRP3炎性小体在细胞质内相互作用并共同定位，NLRP3炎性小体将P2X7受体激活后K+通道打开，K+外流激活NLRP3，促进炎症反应[49]。NLRP3炎性小体的激活是视网膜病变中促炎作用进展的关键，抑制P2X7受体可间接降低NLRP3炎性小体的激活。高糖增加了大鼠视网膜中NLRP3炎性小体的表达，体外培养的人视网膜微血管内皮细胞在高糖诱导下，NLRP3炎性小体及其下游细胞因子的水平显著升高[50]。早期应用非诺贝特可通过 P2X7/NLRP3 炎症信号通路延缓DR的发展[51]。

3 小结

DR是糖尿病的常见并发症，可引起不可逆的视网膜损伤。DR是目前工作年龄的成年人视力丧失的主要原因。尽管抗VEGF治疗已成为治疗DR一线疗法并获得较好疗效，但仍存在许多不足，如重复的眼内注射、仅对疾病晚期有效、有效率较低[52]。探讨DR的发病机制寻找新的治疗靶点仍然非常有意义。CD40-ATP-P2X7/NLRP3炎症信号通路在RNVU中起着细胞间信号串扰作用，对该通路进行抑制可以减轻DR炎症反应。强效小分子P2X7受体抑制剂A740003以及AZ10606120能够逆转糖尿病大鼠视网膜微血管通透性增加，降低视网膜中的VEGF和IL-6基因和蛋白表达[44]。因此,对该信号通路的研究为DR的早期干预和治疗提供了新的靶点。