核桃油对大鼠视网膜缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞的影响

刘金长，张海清，王辉，胡成全，徐蕾

（江西省赣州市赣南医学院第一附属医院眼科，江西 赣州 341000）

随着社会的不断发展和生活方式的改变，眼科疾病越来越多，尤其是视网膜缺血之后再灌注造成的损伤病症。该病是指在一定程度缺血后，发生的视网膜功能及结构变化，一般是在为视网膜血流实施再灌注时导致的损伤。核桃油具有很高的营养价值，除含有多种维生素还有更多的微量元素[1-2]。将核桃油应用于治疗视网膜缺血再灌注损伤中具有一定的科学依据。但相关研究只是在提取方法和成分分析及分离方面，关于视网膜神经的营养研究较少[3-4]。因此，本研究主要分析核桃油在视网膜缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞凋亡中产生的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取Sprague Dawley成年大鼠90只，雄性，体质量200～300 g，随机分为正常组、视网膜缺血实施再灌注组（RIR）及核桃油组，每组30只。正常组大鼠给予常规治疗，无任何手术操作，其他两组大鼠实施前房穿刺，在缺血1 h后再次灌注，其中，RIR组大鼠不给予干预，核桃油组成功造模后喂养核桃油7 d。3组大鼠均选择左眼对照。大鼠眼部和角膜透明度进行裂隙灯检，所有大鼠的晶体均无任何浑浊，均未发生眼底病变问题。

实验试剂及水合氯醛购自天根生化科技企业，NGF、酒精、甲醛溶液及PBS购自北京市赛驰生物有限公司；SABC试剂盒和BAX及BCL-2等购自武汉市博士德生物公司。本研究符合动物伦理委员会相关标准。

1.2 方法

1.2.1 构建RIRI模型 通过前房穿刺术升高大鼠的眼内压，并对视网膜的中央动脉导致的视网膜缺血现象进行阻断，这是现阶段应用较多的一种RIRI模型建立的模型。首先进行称重，需10%的水合氯醛，通过300 mg/kg的剂量为大鼠进行腹腔注射，麻醉起效后，取大鼠卧位，并固定其头部，为右眼进行造模，然后选择0.3%的奥布卡因滴眼液为大鼠进行局部的麻醉。将0.9%氯化钠溶液和输液器头皮针顺着颞侧角巩膜缘的位置向眼前房进行刺入，防止损伤虹膜以及晶体。打开输液器开关，升高输液袋，与实验眼的垂直距离保持为150 cm，大鼠的眼内压达到110 mmHg，球结膜和虹膜及视网膜会迅速变苍白，此时大鼠的视网膜中央的动脉阻断供血，选择胶带固定头皮针。实施1 h高压灌注，降低输液袋，保持和眼球同水平，球结膜和虹膜颜色会快速恢复正常，同时，大鼠眼底的视网膜开始向橘红色恢复，受阻的血流再次被开放，灌注形成。完成手术后运用左氧氟沙星的滴眼液防止术后感染。正常组不实施手术，其余均实施前房穿刺术。

1.2.2 统计视网膜的神经节细胞数量 完成造模后，需在灌注后7 d，及时为大鼠摘除眼球，同时保留1 mm视神经，通过酸性的福尔马林液进行固定，实施石蜡包埋和视网膜铺片，选择每组实施再次灌注7 d后的石蜡切片，给予免疫组化的染色计数。通过显微镜放大400倍，取3个视野观察，并且计数。

1.2.3 测定氧化指标 灌注7 d后为所有大鼠进行麻醉，并收集血液，4℃离心选择血清，通过黄嘌呤氧化酶方法测定的活性SOD对吸光度进行测定。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以“”表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 核桃油对RIRI视网膜SOD及MDA含量的影响 造模7 d后，缺血再灌注组的大鼠和正常组的大鼠比较，视网膜组织匀浆液SOD活性降低，MDA含量提高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；核桃油喂养组大鼠和缺血再灌注组的大鼠比较，视网膜组织的匀浆液SOD活性明显升高，MDA含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 核桃油对RIRI视网膜组织SOD及MDA含量的影响（±s）

表1 核桃油对RIRI视网膜组织SOD及MDA含量的影响（±s）

注：SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛

指标SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）正常组89.12±9.72 0.84±0.14缺血再灌注组43.27±10.32 1.78±0.35核桃油喂养组69.72±8.23 1.34±0.32

2.2 RIRI后的BAX和BCL-2蛋白表达比较 对于BAX蛋白性的表达，一般是黄色及棕黄色的染色，存在于细胞浆中。BCL-2的蛋白阳性是黄色及棕黄色，一般是存在于细胞浆中，正常组大鼠中无明显的表达，经过7 d后检测发现，BCL-2蛋白呈阳性，见表2。

表2 RIRI后BAX和BCL-2蛋白表达比较（±s）

表2 RIRI后BAX和BCL-2蛋白表达比较（±s）

指标BAX BCL-2正常组0.268±0.013 0.316±0.019缺血再灌注组0.431±0.019 0.312±0.002核桃油喂养组0.281±0.003 0.456±0.013

3 讨论

正常生理情况下，大鼠细胞经过氧化后形成活性氧水平波动会在具体的范围中，细胞内抗氧化的防御体系发生很大的改变，继而使各个水平均实现氧化以及抗氧化的平衡。本研究结果显示，与正常组比较，模型组SOD活性降低，MDA升高，视网膜缺血实施再次灌注时，该组大鼠的机体组织中的抗氧化酶活性得到降低，同时，脂质过氧化加重了损伤的程度。与模型组比较，实验组大鼠的SOD活性明显升高，MDA降低，说明视网膜缺血实施再次灌注损伤期间核桃油发挥保护性效果[5-6]。

本研究结果显示，RIRI中凋亡的效果，BCL-2蛋白以及BAX蛋白表达受再灌注时间的影响，在6 h时RGC已明显凋亡，长时间后，BCL-2蛋白的表达明显增强，同时BAX表达增强，24 h开始达到高峰，48 h开始下降，但仍维持较高水平，至3 d减少。此时促凋亡的因素比较明显，导致RGC受损程度逐渐加重，最终死亡。因此，可推测出，核桃油的应用会对BCL-2蛋白表达和BAX蛋白表达产生抑制效果，继而对RIRI中视网膜的神经细胞凋亡进行抑制[7-8]。