乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响研究

李怡成，王元敏

（1.湖南农业大学生物科学，湖南 长沙 410128；2.烟台市莱阳中心医院感染科，山东 烟台 265200）

肝癌作为临床常见恶性肿瘤，其主要诱发因素包括脂肪肝、肥胖、糖尿病、酒精、黄曲霉毒素、乙肝病毒感染等，死亡率较高，对肝癌患者进行早期诊断与治疗较为重要[1]。HepG2来源于人体肝癌组织，人VASORIN蛋白（VASN）主要表达于肾脏、血管平滑肌细胞等，正常情况下，VASN仅在机体大动脉的血管平滑肌细胞表面呈高表达，少量表达于胎盘与肾脏，微弱表达于肝脏、胸腺、脑、心等，但肝癌发生时，HepG2细胞来源的外泌体中也存在VASN蛋白，HepG2细胞株中VASN蛋白表达水平较高，且肝癌组织、肝癌细胞中VASN蛋白呈高表达水平[2]。乙醇的主要代谢器官为肝脏，其在乙醇长期影响下易受到严重损伤[3]。为阐明乙醇在肝癌发生发展中的作用，本研究旨在分析乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达及其分泌情况的影响，以期为生物学细胞研究等提供有效参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞HepG2为本室保存；VASN标准品与VASN抗体由Abnova公司提供；DMEM培养基、胎牛血清购自赛默飞公司；胰酶干粉由科邦兴业提供；超敏发光液由Thermo Fisher提供；Ploy（A）聚合酶来自BioLabs；细胞培养箱为Thermo Scientific产品，高速冷冻离心机由Hitachi公司提供，蛋白电泳仪购自BioRad，紫外分光光度计由Pharmacia提供，实时荧光定量PCR仪由Stratagene提供。

1.2 方法 使用不同浓度乙醇处理液对HepG2细胞进行刺激，分别在24、48、72 h收集细胞，应用荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）检测HepG2细胞VASN信使核糖核酸（mRNA）水平的变化，取超滤浓缩后的样品进行分泌水平检测，分析乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响。细胞培养：在含有10%胎牛血清的DMEM培养基对HepG2进行培养，保持培养箱5%CO237℃。在细胞密度90%时传代，弃去原培养基，磷酸缓冲液（PBS）清洗，在离心管中置入细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，将上清液弃去，细胞传代，DMEM培养基冻存。乙醇刺激：将处于对数生长期的细胞弃去细胞培养基，清洗2次并加入无血清培养基配置的25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L乙醇处理液，分别处理24、48、72 h。细胞总蛋白提取：乙醇刺激后弃去乙醇处理液，PBS缓冲液对细胞进行2次漂洗；将预冷过的PBS缓冲液加入培养板，用细胞刮刀刮下HepG2，在EP管内移入细胞悬浮液1 000 r/min离心5min；将上清弃去，PBS缓冲液对细胞进行1次洗涤，1 000 r/min离心5 min，并吸尽上清；将RIPA蛋白裂解液加入细胞裂解，离心，收集上清细胞总蛋白。

2 结果

2.1 乙醇刺激与HepG2细胞VASNmRNA蛋白表达水平与无乙醇刺激相比，25 mmol/L浓度乙醇刺激、50 mmol/L浓度乙醇刺激、100 mmol/L浓度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2细胞VASNmRNA水平均明显较高，见表1。

表1 HepG2细胞VASNmRNA蛋白表达水平Table 1 HepG2 Protein expression levels VASNmRNAcells

2.2 乙醇刺激与HepG2细胞VASN蛋白分泌水平 与无乙醇刺激相比，25 mmol/L浓度乙醇刺激、50 mmol/L浓度乙醇刺激、100 mmol/L浓度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2细胞VASN蛋白分泌水平均明显较高，见表2。

表2 HepG2细胞VASN蛋白分泌水平Table 2 HepG2 Protein secretion levels VASN cells

3 讨论

肝癌病死率较高，仅次于肺癌，对其进行早期诊断对临床治疗具有重要意义。在恶性肿瘤的产生与增殖过程中，机体对肿瘤异常反应或者肿瘤相关基因及其产物异常表达促成的异常生成或增长的生物活性物质即肿瘤标志物，其对肿瘤的存在与生长具有一定的反映作用。在正常组织中或良性病变中，肿瘤标志物的表达通常较为微弱，但其异常表现于肿瘤的发生发展过程中，因此，其对肿瘤的诊断、预后评估等具有重要作用。HepG2是一种来源于人体肝癌组织的肝癌细胞，乙醇的刺激与肝癌的发生发展具有一定的关联，而VASN蛋白是典型的Ⅰ型跨膜蛋白之一，近年来多项研究表明其在多种实体瘤中表达，且其表达水平与肿瘤恶性程度联系密切[4-5]。同时，VASN蛋白通常在胎盘、肾脏、肝脏、胸腺、脑等表达水平较低，在肝癌患者的癌细胞、肿瘤组织、血清中的表达均呈较高水平，已被证实为潜在的肿瘤标志物。

本研究结果显示，与无乙醇刺激相比，25 mmol/L浓度乙醇刺激、50 mmol/L浓度乙醇刺激、100 mmol/L浓度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2细胞VASNmRNA水平均明显较高；与无乙醇刺激相比，25 mmol/L浓度乙醇刺激、50 mmol/L浓度乙醇刺激、100 mmol/L浓度乙醇刺激在24、48、72 h下HepG2细胞VASN蛋白分泌水平均明显较高。结果提示，乙醇具有诱导HepG2细胞VASN蛋白分泌及表达的作用。分析其原因可能为，不同浓度乙醇可对细胞生命活动产生不同影响，1.5 mmol/L的乙醇可明显提高胰腺导管腺癌细胞的细胞膜通透性，100 mmol/L乙醇对外泌体的分泌、肿瘤血管生成、肝癌细胞的迁移等具有促进作用，而肝癌肿瘤受无水乙醇直接刺激，引起细胞内蛋白质凝固变性与肝癌肿瘤细胞脱水，诱导肿瘤细胞坏死[6-7]。慢性乙醇刺激影响下，HepG2细胞多种基因表达改变，对脂质代谢、碳代谢、氨基酸代谢、应激反应等途径造成影响。同时VSAN蛋白可能在肝癌的发生发展中具有作用，是一种新型肝癌标志物，可能由于VASN蛋白与机体血管损伤修复、机体发育等相关[8]。因此，乙醇具有诱导HepG2细胞VASN蛋白分泌及表达的作用[9]。另外，作为癌的早期筛查指标，在肝癌发生发展过程中，甲胎蛋白（AFP）参与肝癌细胞增殖、血管生成和凋亡等过程，而VASN蛋白对AFP参与的肝癌发生过程具有协同作用，具体机制包括：①VASN可能对AFP的调节过程进行参与与协同；②由于肝癌的病情与预后可经过AFP水平反映，而当细胞向好的方向转化，同时VASN蛋白水平下降时，AFP水平呈降低趋势；③可能存在miRNA或转录因子的影响其他的调节机制。孙乐桥等[10]研究中，经过Western试验发现，HepG2细胞VASN蛋白表达水平提升，划痕愈合实验发现，在乙醇刺激下，HepG2细胞VASN蛋白的分泌增多，说明乙醇刺激可促进HepG2细胞VASN蛋白表达水平和分泌水平升高。

综上所述，乙醇可促进HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的提高，利于为生物学细胞研究等提供有效参考。