有氧运动对高脂诱导肥胖大鼠睾丸组织自噬水平及炎症因子影响研究

夏 俊，李宁川，宣 磊，沈紫璇

有氧运动对高脂诱导肥胖大鼠睾丸组织自噬水平及炎症因子影响研究

夏 俊1，李宁川2，宣 磊1，沈紫璇1

1.安徽省体育科学技术研究所，安徽 合肥，230000；2.扬州大学体育学院，江苏 扬州，225000。

研究目的：通过施加有氧运动干预高脂诱导肥胖大鼠，探究其对高脂饮食产生的肥胖所引起的机体炎症与自噬之间的关系。研究方法：40只SD大鼠随机分为4组，正常对照组（NC，10只）、高脂饲料组（HC，10只）、普通运动组（CE组，10只）、高脂运动组（HE，10只）。按照实验要求，NC组和CE组喂以普通饲料，HF组和HE组喂以高脂饲料。CE组和HE组进行10周的游泳运动干预，采用ELisa和RT-PCR法分别检测大鼠脂代谢、炎症因子和自噬相关因子指标。研究结果：（1）与NC组相比，HF组大鼠Lee`s指数明显升高（P<0.01）；与HF组相比，10周游泳运动大鼠体重、Lee`s指数显著下降（P<0.01）。（2）与NC组比较，HF组TG、TC、LDL均显著升高（P<0.01），HDL显著降低（P<0.05）；CE组TG、TC均显著升高（P<0.01），LDL显著降低（P<0.05）。与HF组比较，HE组TG显著降低（P<0.01），TC、LDL显著降低（P<0.05）。（3）与NC组相比，HF组NF-kB、IL-6水平均有显著性升高（P<0.01），CE组NF-kB、IL-6水平也有显著性降低（P<0.05）；与HF组相比，HE组NF-kB、IL-6水平均显著降低（P<0.05）。（4）与NC组相比，HF组Bclin-1、LC3 II值明显降低，但无显著性差异，P62值具有显著性增加（P<0.05），CE组Bclin-1、LC3 II值明显降低，P62值明显升高，但均无显著性差异；与HF组相比，HE组Bclin-1、LC3 II值呈显著性升高（P<0.05），P62值显著性降低（P<0.01）。研究结论：长期有氧运动能够提升高脂膳食肥胖大鼠睾丸组织自噬活性，进而抑制炎症因子的表达，使大鼠睾丸组织炎症水平有所改善。

有氧运动；自噬；炎症；高脂饮食；肥胖

高脂饮食可引起肥胖，以及使得机体脂代谢紊乱，严重肥胖可引起男性生殖功能障碍[1]。以往实验表明，有氧运动能够改善脂代谢紊乱，减缓脂质沉积以起到减脂减肥的作用然而对高脂膳食所引起的机体炎症成因却没有明确的解释[2]。运动与摄食限制等手段可有效控制肥胖。通过运动对肥胖症大鼠自噬的研究中，大多数都将肌肉、脂肪作为靶器官或靶组织[3]，而关于睾丸组织作为生殖功能的重要器官的肥胖引起的自噬变化却非常少。因此，本研究选取有氧运动干预方式，探究其对高脂饮食产生的肥胖所引起的机体炎症中自噬与炎症之间的相互影响，旨在为高脂饮食所致睾丸组织炎症的改善提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄雄性SD大鼠，体重在140±10g，先适应性饲养一周后，在随机分为4组，饲养环境为12h光照循环，温度保持在25℃左右。实验大鼠均从江苏大学动物实验中心购买。

1.2 实验分组

所有大鼠适应性饲养1周后，随机分为4组：正常对照组（NC组，10只）；高脂饲料组（HF组，10只）；正常运动组（CE组，10只）；高脂运动组（HE，10只）。按照实验要求，正常组大鼠投喂普通固体饲料，高脂组大鼠投喂高脂谷底饲料。普通饲料购于江苏协同生物有限公司。高脂饲料按配方80.5%的基础饲料，14%的猪油，2%的胆固醇，0.5%的胆盐，3%的麻油，由江苏协同生物有限公司按配方加工。

1.3 运动方案

通过每天1h游泳训练干预大鼠进行实验，在第1周时，先进性10min适应游泳训练，之后每天递加10min，第6天达到60min运动，之后每天保持60min游泳运动量，每周6次，共持续10周。游泳的容器选择100× 80 cm × 80cm的方形塑料桶，每5只在一个标准桶中游泳训练，水温保持在33-35℃。

1.4 实验取血与样本处理

在处死实验大鼠的前1天，停止运动训练，并且禁食12h，但继续保持实验大鼠的饮水供应。在大鼠进行麻醉后测量大鼠体重、体长指标。按照50mg/kg的剂量，注射2%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉。剪开腹腔进行腹主动脉取血，置于抗凝管中静置1h，于离心机内4℃、4000rmp离心15min，制备血清，放于-80℃冰箱保存待测。

1.5 测试指标及检测方法

采用ELISA检测大鼠血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）水平及大鼠睾丸组织中IL-6、NF-kB水平；试剂均购自南京诺唯赞生物有限公司。

1.6 Real-TimePCR检测Beclin-1、LC3-II、P62mRNA的表达

所有引物均由上海生物有限公司以Gene Bank数据库为参考模板，设计合成，Beclin-1-F引物序列cctcctccctggaa acaactaa，Beclin-1-R引物序列tagttagcacagtaagcgttca，p62-F引物序列gaagataaggcttgtcaacgtt，p62-R引物序列tctgagctcact tttacatggt，LC3-II-F引物序列ctaaactaagctatttcggccc，LC3-II-R引物序列caaaagagcaagcctaacaaga。

RT-PCR检测：采用Triol法提取睾丸中的总RNA，使用反转录试剂盒将所提取的睾丸总RNA在核酸扩增仪中反转录获取cDNA，利用荧光定量PCR仪进行样本cDNA的扩增和荧光定量检测。

1.7 统计学处理

用SPSS 20.0统计软件进行处理，采用双因素方差分析和配对样本t检验分析，结果以“平均数±标准差”（X±S）来表示，显著性差异水平为P<0.05，非常显著差异为P<0.01。

2 结 果

2.1 各组实验大鼠体重、体长及Lee`s指数

与NC组相比，HF组大鼠体长无明显差异，但Lee`s指数明显升高（P<0.01）；与HF组相比，10周游泳运动使大鼠体重、Lee`s指数显著下降（P<0.01），体长有明显增加，但无显著性差异；普通饲料饲养大鼠10周游泳运动后，体重、Lee`s指数显著下降（P<0.01），体长无明显差异（表1）。

表1 各组大鼠体重、体长、Lee`s指数（n=10）

注：*表示不同组别与NC组比较差异明显（P<0.05），**表示不同组别与NC组比较显著性差异（P<0.01）；+表示HE与HF组比较存在明显差异（P<0.05），++表示HE与HF组比较存在显著性差异（P<0.01）。下同。

2.2 各组实验大鼠血清脂代谢指标变化

与NC组比较，HF组TG、TC、LDL均显著升高（P<0.01），HDL显著降低（P<0.05）；CE组TG、TC均显著升高（P<0.01），LDL显著降低（P<0.05）。与HF组比较，HE组TG显著降低（P<0.01），TC、LDL显著降低（P<0.05）（表2）。

表2 本研究各组大鼠血清脂代谢指标一览表

注：与NC组相比较，* P<0.05，** P<0.01；与HF相比较+ P<0.05，++P<0.01。

2.3 实验大鼠睾丸组织NF-kB、IL-6变化

与NC组相比，HF组NF-kB、IL-6水平均有显著性升高（P<0.01），CE组NF-kB、IL-6水平也有显著性降低（P<0.05）；与HF组相比，HE组NF-kB、IL-6水平均显著降低（P<0.05）（表3）。

表3 大鼠睾丸组织炎症因子NF-kB、IL-6水平

注：与NC组相比较，* P<0.05，** P<0.01；与HF相比较+ P<0.05，++P<0.01。

2.4 实验大鼠睾丸组织Bclin-1、P62、LC3-II mRNA水平

与NC组相比，HF组Bclin-1、LC3 II值明显降低，但无显著性差异，P62值具有显著性增加（P<0.05），CE组Bclin-1、LC3-II值明显降低，P62值明显升高，但均无显著性差异；与HF组相比，HE组Bclin-1、LC3-II值呈显著性升高（P<0.05），P62值显著性降低（P<0.01）。

表4 实验大鼠睾丸组织Bclin-1、p62、LC3-II mRNA水平

注：与NC组相比较，* P<0.05，** P<0.01；与HF相比较+ P<0.05，++P<0.01。

3 讨论与分析

3.1 高脂膳食诱导营养性肥胖大鼠模型建成

肥胖本身是一种慢性低度炎症的病态，机体脂肪的大量堆积，增加内脏器官压力，机体的长期处于低度炎症状态对多种代谢功能产生阻碍。众多研究者建立的肥胖大鼠模型主要分为自发性肥胖模型、转基因动物模型、营养性肥胖动物模型，本实验所采用的肥胖大鼠模型采用的是高热量饲料建成的肥胖大鼠模型[4,5]。营养性肥胖模型成功建立并没有统一的标准，通常以高脂饲养组体重超过普通饲养组体重20%为依据，Lee`s指数具有显著性升高以及血清脂代谢指标具有显著性变化[6]。肥胖大鼠模型的建立成功一般参考高脂组大鼠比肥胖组大鼠体重高20%，且血清4项指标具有显著差异。本实验中，通过10周的饮食干预，高脂空白组大鼠较空白对照组高出20%，且与NC组相比，HF组大鼠血清TG、TC、HDL均显著性升高。其结果与多项高脂饲料诱导的肥胖大鼠模型结果相似，因此可以判定营养性肥胖大鼠模型建立成功。

3.2 有氧运动对高脂膳食肥胖大鼠睾丸组织Bclin-1、P62、LC3-II mRNA水平

肥胖具有脂肪组织不断扩展的特征，当能量摄入过多不能即使消耗是，多余的能量就会转化为甘油三酯储存在脂肪细胞之中。细胞自噬的活性也会跟随机体环境的改变而发生变化，在低度炎症的肥胖状态下，自噬活性随之改变。Yoshizaki通过建立GFP-LC3转基因小鼠模型，进而进行16周的高脂饮食干预，日本学者Yoshizaki等通过GFP-LC3转基因小鼠进行16周正常膳食和高脂膳食干预后发现，小鼠附睾脂肪GFP-LC3信号分布出现显著性区别，在正常饮食的小鼠附睾脂肪中信号以散点式分布，高脂膳食干预组的小鼠同样是附睾脂肪中，却检测不到GFP-LC3信号分布，提示肥胖症小鼠睾丸组织的自噬水平有所降低[7]。在本实验中，HF组大鼠较NC组大鼠相比，大鼠睾丸组织自噬标志物LC3II和Beclin1具有明显降低，P62水平有所上升，但均没有显著性差异，结果显示高脂膳食饲养大鼠自噬活性受到抑制并有所减弱。

He等研究发现，通过运动训练干预能够对野生型小鼠骨骼肌细胞的自噬活性起到促进的作用。同时，运动训练能够减轻野生型小鼠度长期高脂饮食有诱导的葡萄糖耐量以及高脂血症等症状降低[8]。崔迪等研究表明，营养过剩肥胖小鼠骨骼肌ULK1、ATG13、LC3 mRNA及LC3II/LC3I比值降低导致骨骼肌细胞自噬水平下降，导致细胞内代谢废物不能够及时清除，而耐力训练集合膳食改善可有效增加LC3的含量，使骨骼肌细胞自噬水平得以提高[9]。Roche等在进行9周高脂诱导肥胖大鼠的实验中，肥胖组大鼠的自噬因子Beclin1和LC3II相较于对照组，均具有显著性升高[10]。本实验中，通过10周游泳运动，HE组大鼠较HF组大鼠睾丸组织自噬标志物LC3II和Beclin1均具有显著性增加，P62显著性降低，提示运动改善并提高了大鼠睾丸组织自噬活性。

3.3 自噬介导有氧运动对高脂膳食大鼠睾丸组织炎症因子的影响

研究表明，肥胖中脂肪因子的炎症因子和自噬标志物之间存在相互介导及调节的作用[11]。通过高脂膳食诱导的肥胖大鼠中脂肪因子的自噬活性相较于正常对照组及偏瘦体重组，自噬标志物LC3蛋白表达的变化明显，具有显著性增加。在体外实验的离体细胞培养中，采用自噬抑制剂处理培养细胞，检测到炎症因子IL-1β、IL-8的额转录和蛋白表达具有显著增加[12]。在本研究中，与HF组相比，HE组大鼠睾丸组织NF-kB、IL-6水平均显著性降低，之前结果显示，通过10周有氧运动发现，HE组相较于HF组大鼠睾丸组织自噬标志物发生显著性变化，提示自噬活性具有显著增强。提示有氧运动可通过自噬活性增强进而减缓睾丸组织炎症水平。许多研究证实自噬能够负性调节炎性机体的激活[13]。用LPS刺激Atg 16L1缺乏的巨噬细胞会激活caspase-1，使IL-1β和IL-18释放增加[14]。在福氏志贺菌感染时，细菌诱发的液泡膜残余物会激活caspase-1，并结合LC3和P62上，被运送至自噬溶酶体进行降解，从而抑制炎症反应[15]。

4 结 论

长期有氧运动能够提升高脂膳食肥胖大鼠睾丸组织自噬活性，进而抑制炎症因子的表达，使大鼠睾丸组织炎症水平有所改善。

[1] 李宁川，胡玉龙，陈小燕，等.游泳运动对高脂膳食诱导大鼠精子凋亡的影响[J].北京体育大学学报，2014，37（06）：66～69.

[2] 李志刚.耐力运动对营养性肥胖大鼠Galectin-3表达的影响[J]中国运动医学杂志，2018，37（07）：588～593.

[3] 张礼刚，陈先国，等.细胞自噬和炎症小体相互作用的研究进展[J].临床泌尿外科杂志，2015，35（07）：980～984.

[4] 孙 波，李 辉，等.肥胖与慢性炎症[J].生物学杂志，2013，4（01）：28～29.

[5] Landry D, Cloutier F, Martin LJ.Implications of leptin in neuroendocrine regulation of male repuduction [J]. Reprod Biol, 2013(13): 1～14.

[6] 孙 志，张中成，刘志诚.营养性肥胖动物模型的实验研究[J].中国药理学通报，2002，18（04）：466～467.

[7] Yoshizaki T, Kusunoki C, Kondo M, et al. Autophagy regulates inflammation in adipocytes.Biochen Biophys Res Commun, 2012, 417: 352～357.

[8] He CC, Bassik MC, Moresi V, et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature, 2012, 481(7382): 511～515.

[9] 崔 迪，邱守涛，王海燕，等.耐力运动对营养性肥胖小鼠骨骼肌细胞自噬及线粒体自噬的影响[J].体育科学，2014（12）：63～71.

[10] Rocha-Rodrigues S. Beleza J. Goncalves IO, et al. Endurance training attenuates autophagy and inflammatory changes in visceral adipose tissue from rats in long-standing high-fat diet-induced obesity.Eur J Clin Invest, 2014, 44: 77.

[11] 赵永军，何玉秀.自噬介导运动改善肥胖症脂肪组织炎症状态研究进展[J].中国运动医学杂志，2016，35（07）：675～681.

[12] 任彩媛，张向颖，时红波，等.自噬调控脂多糖诱导的巨噬细胞炎症因子水平[J].细胞与分子免疫学杂志，2017，3（05）：581～585.

[13] Shi CS, Shenderov K, Huang N N, Kabat J, Abu-Asab M, Fitzgerald K A, Sher A,Kehrl JH. Activation of auto phagy by imflammatory signal limits IL-1beta production by targeting ubiquiti nated imflammasomes for desteuction.Nat Immunol 2012, 13: 255～263.

[14] Saitoh T, Fujita N, Jang MH, Uematsu S, Yang BG. Akira S, Loss of the a utophagy protein Atg16L1 enhances endotoxin induced IL-1beta production.Nature, 2008, 456: 264～268.

[15] Dupont N, Lacas-Gervais S. Shigella phagocytic vacuolar men brane remnants participate invasion and are regulated by autophagy. Cell Host Microbe 2009(06): 137～149.

Effect of Aerobic Exercise on Autophagy Level and Inflammatory Factors in Rat Testis Induced by High Fat

XIA Jun1, LI Ningchuan2, XUAN Lei1, et al

1.Anhui Sports Science Institute, Hefei Anhui, 230000, China;2.College of Physical Education Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu, 225000, China.

Objective: To investigate the relationship between inflammation and autophagy induced by obesity induced by high-fat diet in obese rats by aerobic exercise. Methods: 40 SD rats were randomly divided into 4 groups: normal control group (NC, 10 rats), high-fat diet group (HC, 10 rats), normal exercise group (CE group, 10 rats), and high-fat exercise group (HE, 10 rats). According to the experimental requirements, NC group and CE group were fed with ordinary feed, HF group and HE group were fed with high-fat feed. The CE group and HE group underwent 10-week swimming exercise intervention, and lipid metabolism, inflammatory factors and autophagy related factors were detected by ELisa and rt-pcr, respectively. Results: (1) Compared with NC group, Lee's index of rats in HF group was significantly increased (P<0.01). Compared with the HF group, the body weight and Lee's index of the 10-week swimming exercise rats decreased significantly (P<0.01). (2) Compared with NC group, TG, TC and LDL in HF group increased significantly (P<0.01), and HDL decreased significantly (P<0.05). TG and TC in the CE group were significantly increased（P<0.01）, and LDL was significantly decreased (P<0.05). Compared with HF group, TG was significantly decreased in HE group (P<0.01), TC and LDL were significantly decreased (P<0.05). (3) Compared with NC group, levels of nf-kb and il-6 in HF group increased significantly (P<0.01), and levels of nf-kb and il-6 in CE group also decreased significantly (P<0.05). Compared with HF group, nf-kb and il-6 levels in HE group were significantly reduced (P<0.05). (4) Compared with the NC group, the II values of bclin-1 and LC3 in the HF group decreased significantly, but there was no significant difference, while the p62 values increased significantly (P<0.05). The II values of bclin-1 and LC3 in the CE group decreased significantly, while the p62 values increased significantly, but there was no significant difference. Compared with HF group, bclin-1 and LC3 II values in HE group increased significantly (P<0.05), and p62 values decreased significantly (P<0.01). Conclusion: long-term aerobic exercise can improve the autophagy activity of testicular tissue of obese rats with high-fat diet, further inhibit the expression of inflammatory factors, and improve the level of testicular tissue inflammation.

Aerobic exercise; Autophagy; Inflammation; High fat diet; Obese

1007―6891（2021）06―0022―04

10.13932/j.cnki.sctykx.2021.06.06

G804.7

A

2020-03-09

2020-03-24