p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在脑出血中的表达及与病情严重程度相关性研究

朱泽，俞立峰，朱伟东

脑出血是由非外伤性脑实质内血管破裂导致的出血，具有较高的死亡率和发病率，其中17%～55%的患者为急性脑出血，成为威胁人类健康及生活质量的重大疾病之一。脑出血患者发病较为复杂，主要与脑血管的病变有关，与高血脂、糖尿病、高血压、血管老化及吸烟等密切相关。患者常常在情绪激动、费劲用力时突然发病，1个月内病死率高达40%，幸存者中多数留下不同程度的运动障碍、认知障碍或语言吞咽障碍等后遗症。神经营养因子受体p75（p75NTR）为肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，为跨膜蛋白。研究表明神经p75NTR可增加细胞凋亡，加重病情的发展[1]。LINGO-1属于一种Nogo受体作用蛋白，主要存在于含亮氨酸重复系列和免疫球蛋白结构域中，对髓鞘形成、神经元活性具有重要作用[2]。血清微RNA-23a-3p（miR-23a-3p）是miRNA中的一员，广泛调控机体各种生理和病理过程，在细胞分化中起重要作用[3]。本文分析p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在脑出血中的表达及与病情严重程度的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江省诸暨市中医医院2018年5月至2020年5月收治的脑出血患者132例（脑出血组），其中男63例，女69例；年龄50～72岁，平均（58.0±14.0）岁。另选本院健康人80例作为健康组，其中男42例，女38例；年龄50～75岁，平均（59.4±12.5）岁。两组一般资料差异无统计学意义（均＞0.05）。本研究经本院伦理委员会审核批准，患者家属均知情同意并签署了知情同意书。

纳入标准：符合脑出血诊断标准[4]，且经颅脑CT扫描证实有出血灶，患者神经功能发生缺损，伴有呕吐、头疼、血压升高等症状。排除标准：伴有凝血功能障碍、感染性疾病者；心肺、肝肾等重要器官损伤；行激素、免疫抑制剂治疗者；因颅内畸形导致的脑内出血者；蛛网膜下腔出血、出血性脑梗死者；患有感染性疾病者；既往有脑器质行疾病者。

1.2 方法

1.2.1 p75NTR、miR-23a-3p检测 采集研究对象清晨空腹静脉血8 ml，以离心半径8cm，转速3000r/min，进行10min离心处理，分离出上层血清，保存于－20℃冰箱中待用。采用Trizol法提取样本RNA，使用Takara逆转录试剂盒行逆转录处理后获得总cDNA，采用Primer 5.0软件设计引物序列，启动PCR仪，反应体系：0.4 l上下游引物、1 lcDNA模板、10 l SYBGreen，加蒸馏水至20 l。反应条件：95℃预变性1 s、95℃5 s、60℃31 s，共进行40个循环，采用2－△△Ct方法计算出p75NTR、miR-23a-3p表达量。p75NTR上 游 引 物 序 列：5’-AACAAGACCTCATAGCCAGCA-3’，下游引物序列：5’-CAGGATGGAGCAATAGACAGG-3’；miR-23a-3p 上 游 引 物 序 列：5’-GCGATCACATTGCCAGGG-3’，下游引物 序 列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；内参U6引物序列：上游：5’-CTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.2 LINGO-1检测 收集研究对象空腹静脉血8 ml，将其置于离心管中，以12000r/min离心5min，取上清，于－20℃保存。取50 g蛋白加入2×SDS凝胶缓冲液，在95～100℃中加热5～15 min使蛋白变性。之后将分离的蛋白质转膜、取模，4℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间1 h，用封闭液稀释一抗后加入洗涤液，待吸尽封闭液后加入稀释好的一抗，缓慢摇动孵育1～2h后加入洗涤液，摇动5min，吸完后重复加入，洗涤5min 3次。吸进洗涤液后加入用封闭液稀释好的二抗，缓慢摇动孵育1～2 h后加入洗涤液，再次连续洗膜5min 3次。定量分析蛋白表达情况，以GAPDH为内参。

1.2.3 严重程度评估 采用美国国立卫生研究院脑卒中评分量表（NIHSS）评估病情严重程度，重度：NIHSS＞15分，肌力为0～Ⅰ级，患者出现意识重度障碍。中度：NIHSS5～15分，肌力为Ⅱ～Ⅲ级，出现中度意识障碍。轻度：NIHSS1～4分，肌力在Ⅲ级以上，患者意识清楚。

1.3 统计方法 采用SPSS26.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差表达，多组比较采用方差分析，两组比较采用独立样本 检验；危险因素分析采用二分类多因素Logistic回归模型分析；相关性分析采用Pearson相关分析＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康组和脑出血组p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比较脑出血组p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平高于健康组（均＜0.05），见表1。

表1 健康组和脑出血组p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比较

2.2 不同脑出血严重程度患者p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比较 重度脑出血患者32例，中度脑出血患者44例，轻度脑出血患者56例。随着脑出血严重程度的加重，p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p的升高加剧（均＜0.05），重度脑出血＞中度脑出血＞轻度脑出血患者（均＜0.05）。见表2。

表2 不同脑出血严重程度患者p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p水平比较

2.3 影响脑出血严重程度的多因素分析 将脑出血发生作为因变量，将p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p作为自变量，纳入二分类多因素Logistic回归模型分析，结果显示p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p为影响脑出血严重程度的独立危险因素（均＜0.05），见表3。

表3 影响脑出血严重程度的多因素分析

2.4 p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p之间相关性分析 p75NTR与LINGO-1呈正相关（=0.479＜0.05），p75NTR与miR-23a-3p呈正相关（=0.388，＜0.05），LINGO-1与miR-23a-3p呈正相关（=0.361＜0.05）。

3 讨论

脑出血的发生是由脑血管病变引起的，当血流流入脑实质中，破坏脑实质正起血脑屏障破坏，影响患者预后[5]。

p75NTR属于跨模型蛋白，在神经细胞的分化、生存、凋亡中发挥着重要作用，其与细胞凋零有关，可以使体外培养的雪旺氏细胞、运动神经元、感觉神经元和交感神经元发生凋亡，下调或阻断p75NTR表达可以减少凋亡[6]。本研究结果显示，脑出血发病后，p75NTR表达明显升高，且随着病情的发展表达加剧。这表示p75NTR与脑出血患者的病情、严重程度存在一定联系。

LINGO-1是一种重要的跨膜蛋白、脑内神经再生抑制因子，可以负向调节少突胶质细胞分化、抑制神经元生长和髓鞘生成，其在神经干细胞成熟过程中调节神经元的凋亡[7]。研究表明，LINGO-1可以抑制轴突再生、少突胶质细胞分化和髓鞘形成、神经元存活[8]。本研究结果显示，LINGO-1随着脑出血的发生逐渐升高，且随着病情的加重升高加剧。这表示LINGO-1与脑出血患者的病情、严重程度存在一定联系。

miR-23a-3p是一种功能性miRNA，与多种炎症疾病存在密切联系[9-10]。miR-23a家族包括 miR-23a-5p和miR-23a-3p。miR-23a-3p在细胞的增殖、分化、凋亡等生物学活动中发挥着重要作用；此外，其在其他疾病治疗中也发挥着重要作用。miR-23a-3p的异常表达与疾病的部分临床特征有关，可以作为诊断相关疾病，预测疾病复发和预后的重要指标。本研究结果显示，miR-23a-3p在脑出血患者体内升高，且随着病情的加重逐渐升高。这表示miR-23a-3p与脑出血患者的病情、严重程度存在一定联系。本研究还发现p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p三者间均呈正相关，提示着三者可能共同参与此病的发生进展，但本研究并未深入分析其具体作用机制，还需后续研究进一步分析验证。