黑果小檗总花色苷对帕金森大鼠认知行为能力、神经保护及Klotho基因表达的研究

李文杰，罗远，刘婷，姚麒

帕金森病（PD）主要病理改变为多巴胺能神经元缺失，属于中枢神经系统退行性疾病，而PD患者最常见的非运动症状就是认知功能障碍（CI）[1]。黑果小檗是一种落叶灌木植物，资源丰富，具有强胃、生津止渴、清热解毒的功效[2]。有研究发现，黑果小檗果实中花色苷具有增强抗氧化防御系统，提高老龄动物的记忆力，调节胆碱能神经传递等治疗神经退行性疾病的作用[3]。Klotho是一种衰老抑制基因，Kl蛋白功能下降会导致多巴胺能神经元的数量下降，抑制多巴胺的合成，PI3K-PKB磷酸化激活转录调节因子FoxO，进而参与神经元细胞凋亡、衰老及代谢[4]。本研究探究黑果小檗总花色苷（BHSTA）对帕金森大鼠的认知行为能力、神经保护及Klotho基因表达的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 80只SPF级雄性大鼠，体质量220～250 g，8周龄，均置于温度为22～25℃，湿度为40%～50%的动物房内统一饲养。

1.2 药材 黑果小檗源于乌鲁木齐市南山山区，经鉴定为小檗科小檗属植物黑果小檗的果实，提纯后得到BTA冻干粉末（含量为39%）。

1.3 试剂 盐酸阿扑吗啡，6-羟基多巴（6-OHDA），多聚甲醛，中性树脂，Klotho抗体、Foxo3a及P-Foxo 3a抗体。

1.4 PD大鼠模型制备 80只大鼠随机分为假手术组15只，模型组65只，将65只大鼠参照文献[5]中双靶点注射法制备PD-CI大鼠模型。水合氯醛麻醉大鼠并固定，大鼠的头部用脑立体定位仪固定，在黑质致密部和中脑腹侧被盖区，15 min内用微量注射器注入4 g/l的6-OHDA。7 d后，大鼠均腹腔注射0.5mg/kg盐酸阿扑吗啡，诱导大鼠的旋转行为，并记录注射后30 min内的旋转次数。模型制备成功标准：旋转次数≥7次/min。在制成PD大鼠模型过程中有5只大鼠死亡，剩下60只大鼠均制备成功。假手术组大鼠注射等量含0.2 g/L抗坏血酸的0.9%氯化钠注射液，手术方法同模型组。

1.5 大鼠分组及给药 将造模成功的60只大鼠随机分为模型组（予0.9%氯化钠注射液灌胃）、低剂量组（予54.6mg/kg BHSTA灌胃）、中剂量组（予109.3 mg/kg BHSTA灌胃）和高剂量组（予218.6 mg/kg BHSTA灌胃），各15只。假手术组大鼠给予等量的0.9%氯化钠注射液灌胃干预。1次/d，连续给药28d。

1.6 神经行为学检测 观察大鼠行为改变，行旋转诱导实验，记录30min内大鼠旋转圈数，并计算其平均旋转圈数。

悬挂实验：将大鼠前肢悬挂于离地面30 cm高的金属丝上，记录从开始悬挂至落地时的时间并评分。评分标准：持续0～5 s记为0分，6～10 s记为1分；11～15s记为2分，16～20s记为3分，21～25 s记为4分，26～30 s记为5分，超过30 s记为6分，实验3次，取平均值，每次实验时间间隔约2 min。

1.7 Morris水迷宫实验 将水池分为大小相同的4个象限，于3象限内的中间位置放置一个圆形的位于水面下2cm的黑色站台，并在池壁内侧做好不同形状的标记。将摄像机置于迷宫的上方，记录大鼠的运动轨迹。计算大鼠在平台所有象限的距离百分比（PT%）和停留时间百分比（T%）。

1.8 样本采集 行为学实验结束后，取大鼠脑组织，分离获得脑黑质，一部分用多聚甲醛固定，在4℃冰箱中保存备用；另一部分冻存于液氮中。

1.9 TUNEL染色检测神经元凋亡 用多聚甲醛固定备用的脑黑质，24 h后石蜡包埋，切片，置于冰箱备用。取出切片，洗涤后封闭1 h。加入一抗在4℃的环境中孵育过夜；再次洗涤后加入带有荧光标记的二抗，孵育1 h后洗涤，置于显微镜下观察。

1.10 蛋白质印迹测定脑黑质中Klotho、Foxo3a、p-Foxo3a蛋白表达 取液氮冻存的脑黑质，研磨裂解后取蛋白样本。取30g蛋白样本煮沸、电泳、PVDF膜转印，加入Klotho及p-Klotho一抗、Foxo3a及p-Foxo3a一抗、羊兔抗HRP标记二抗，蛋白质印迹法测定神经元内Klotho和p-Foxo3a蛋白表达，并测定蛋白的相对灰度值。

1.11 统计方法 采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BHSTA对大鼠的神经保护功能 与假手术组相比，模型组大鼠旋转圈数增多，悬挂实验评分降低（均P＜0.05）；低、中和高剂量组大鼠的旋转圈数少于模型组，悬挂实验评分高于模型组（均P＜0.05）；高剂量组大鼠旋转圈数低于低剂量组，悬挂实验评分高于低剂量组（均P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠旋转圈数和悬挂实验评分比较

2.2 BHSTA对大鼠认知功能影响 与假手术组相比，模型组大鼠PT%、T%值降低（均P＜0.05）；低、中和高剂量组PT%、T%值均高于模型组（均P＜0.05）；高剂量组大鼠PT%、T%均高于低剂量组（均P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠PT%、T%比较

2.3 BHSTA对神经细胞凋亡的影响 相对于假手术组，模型组大鼠脑组织中神经细胞凋亡明显增多（均P＜0.05）；而与模型组相比，低、中和高剂量组神经细胞凋亡均降低（均P＜0.05），且凋亡程度呈浓度递减趋势，高剂量组神经细胞凋亡情况低于低剂量组（均P＜0.05），见封二彩图1。

2.4 Klotho、Foxo3a、p-Foxo3a蛋白的表达情况 与假手术组相比，模型组Klotho和Foxo3a蛋白表达显著降低，p-Foxo3a蛋白表达明显升高（均P＜0.05）；与模型组相比，低、中和高剂量组Klotho和Foxo3a蛋白表达均不同程度的增加，p-Foxo3a蛋白表达均显著降低（均P＜0.05），且高剂量组蛋白变化与低剂量组差异有统计学意义（均P＜0.05），见封二彩图2。

3 讨论

PD是一种椎体外系变性疾病，临床常用手术干预或药物替代治疗，但手术创伤和药物依赖会加重认知障碍的风险[6]。黑果小檗果实中的花色苷有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，常用于治疗亨廷顿病、局部缺血性脑卒中等疾病[7]，但关于BHSTA应用于PD的研究少有报道。本研究显示模型组大鼠旋转圈数增多，悬挂试验评分降低；BHSTA干预后的低、中、高剂量组大鼠旋转圈数减少，悬挂实验评分升高。这提示BHSTA可改善PD大鼠的神经功能。水迷宫实验结果显示，BHSTA能增加PT%和T%值，增强PD大鼠的认知记忆能力。既往研究也证实，BHSTA可有效改善AD大鼠的CI和脑组织损伤[8]。

研究发现，PD患者临床表现有脑萎缩，主要累及海马、钩回及后扣带回等部位。PD-CI脑功能的退行性改变可能与海马区神经元线粒体损伤、自由基调节失衡、能量代谢障碍或细胞衰老有关[9]。Klotho基因与衰老的调控关系密切，Klotho基因缺陷的大鼠通常会出现衰老等症状，通过增加Klotho基因表达，可抑制胰岛素样生长因子-1信号，进而延长大鼠的寿命，Klotho高表达可以抑制其下游Akt激活底物中的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化[10]。即Klotho减少会激活Akt通路，导致Foxo3a转录因子磷酸化和细胞中SOD表达减少，积聚MDA，进而对细胞中的蛋白质和DNA造成损伤，致细胞衰老。本研究结果显示，模型组大鼠Klotho、Foxo3a表达显著降低，p-Foxo3a表达升高。这说明PD大鼠神经元Foxo3a表达降低，使进入细胞核内的Foxo减少，引起细胞衰老；通过BHSTA干预使PD大鼠的Klotho、Foxo3a表达增加，减少PD大鼠的神经细胞衰老。王思夷等[11]研究证实，盐酸多奈哌齐可能通过上调海马区的Klotho表达，抑制Akt和Foxo3a磷酸化，提高血清SOD含量，进而提高PD大鼠的学习记忆能力。有研究表明黑豆提取物花色苷可提高老年大鼠学习能力，调控胆碱能神经传递及线粒体相关凋亡蛋白活性，从而降低神经元凋亡，对大鼠神经退行性病变、脑损伤等多种神经疾病均有一定改善作用[12]。

综上所述，BHSTA可改善PD大鼠认知行为能力，保护大鼠的神经功能，其作用机制可能是通过调控Klotho、Foxo3a信号通路实现。