miRNA对肝细胞癌微环境的调节作用*

曹 妮 孙建飞 魏海梁△ 李京涛 闫曙光 肖 刚

1.陕西中医药大学 2018级硕士研究生班 (陕西 咸阳, 712046) 2.陕西中医药大学附属医院

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏肿瘤,也是世界癌症死亡的第3大原因,且发病率逐年增加，主要原因是临床早期诊断困难,确诊时多已错过最佳治疗时机。miRNA作为一种在恶性肿瘤发生中起到非常重要作用的短链非编码RNA,通过与其靶基因的特异性结合从转录后水平调控肿瘤相关基因的表达[1]。自miRNA被发现以后，在多种生物体中发现并调查了更多的miRNA,目前，miRNA被公认为可以影响几乎所有生物过程的关键中介，包括发育、免疫反应、分化、增殖、凋亡、入侵和转移。本文从miRNA对HCC的免疫微环境、炎症微环境、血管生成微环境等的调节作用进行综述。

1 miRNA对肝星状细胞及肌成纤维细胞的调节

肝癌微环境中存在着大量的肝星状细胞(HSC)及肌成纤维细胞(MFC)，HSC是构成细胞外基质(ECM)的主要来源，HSC激活并转化为MFC，各种致纤维化因素把HSC作为最终靶细胞。正常情况下HSC处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，HSC被激活，其表型由静止型转变为活化的HSC。激活的HSC一方面通过增生和分泌ECM参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。多种细胞因子和生长因子诱导的肝损伤可以激活HSC，产生α-smooth平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和引起肝纤维化后导致肝硬化，继而形成HCC。miRNA通过不同的机制参与HSC的活化过程调节，从而造成不同的影响。

1.1 miRNA对HSC的活化过程的抑制 Han等[2]发现miR-206是HSC活化和肝纤维化背景下组蛋白去乙酰化酶4抗体(HDAC4)的另一个下游靶点，miR-206可能通过抑制肌钙蛋白相关转录因子-A(MRTF-A)表达来抑制HSC的活化。Khanizadeh等[3]的研究结果表明，丙型肝炎病毒(HCV)中非结构蛋白3(NS3)蛋白不同于无蛋白酶功能的NS3蛋白，可以诱导人造血干细胞的成纤维状态。miR-122可能直接调节纤维化，但其表达在纤维化状态受到明显抑制，在转染NS3的完整和突变形式的HSCs后，对LX-2(人肝癌细胞的一种)细胞中miR-122的基因表达分析表明，与正常细胞或荧光蛋白对照质粒相比，两种NS3蛋白均可导致HSCs中miR-122表达下调，但NS3的感受态形式对miR-122的抑制作用更强。

1.2 miRNA对HSC的活化过程的促进 Si等[4]的研究首次显示转化生长因子-β(TGF-β)是肝纤维化的调节因子,通过调控靶向RNA结合蛋白(如Igf2 bp3)的miRNAs(如Let7)来驱动造血干细胞的成肌成纤维细胞分化，它调节数千个基因表达的协调变化，使HSC能够避免静止，促进(并保持)增殖肌纤维蛋白。此外，miR-140-3p通过刺激蛋白同源(PTEN)基因的沉默促进p-AKT和p-mTOR的水平改善了细胞增殖以及α-SMA和结蛋白的表达，减少了细胞凋亡，并促进纤维形成[5]。

2 miRNA对线粒体微环境的调节

线粒体是细胞质细胞器，在能量代谢和细胞稳态中起多种作用，包括通过呼吸和氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)，活性氧的产生，代谢稳态以及细胞凋亡的启动和执行，产生能量的电子传递链或三羧酸循环都位于线粒体内。miRNA主要位于细胞质或细胞核，miRNA通常通过蛋白复合物阻止其mRNA 靶点的翻译，从而引起线粒体的一系列功能异常。

2.1 对呼吸链的影响 呼吸链又称电子传递链(ETC)是一系列具有递氢、递电子作用的氢载体和电子载体蛋白，由还原型辅酶I、琥珀酸还原酶、细胞色素b-c1还原酶、细胞色素c氧化酶4种复合物组成。线粒体有内、外两层膜，位于膜间隙中的电子传递链由几个蛋白复合物(包括细胞色素c氧化酶)组成，它们产生质子梯度，通过ATP合酶驱动ATP合成。miRNA通过多种方式影响细胞核和线粒体基因的蛋白表达及ETC活性。①miR-338-5p能够影响细胞色素c氧化酶IV和ATP合酶复合物亚基的表达；②在Hela细胞中进行的基因敲除实验显示，其蛋白水平降低了70%，miR-101-3p序列在人、大鼠和小鼠中均具有保守性，在小鼠肝脏的线粒体中也发现了成熟的miR-101-3p；③miR-127-5p调控ATP5B(ATP合成酶β5抗体)，可以使ATP5B蛋白的含量降低50%[6]。

2.2 对三羧酸循环的影响 糖酵解产生丙酮酸作为最终产物，它被丙酮酸脱氢酶转化为乙酰辅酶A,在线粒体基质中，乙酰辅酶A进入三羧酸循环(TCA)。这导致了氧化还原当量的产生，它们进入ETC并驱动电化学质子梯度。柠檬酸合酶将乙酰辅酶A与草酸融合，催化三羧酸循环的起始步骤。anti-mir-122-5p处理小鼠可使脂肪酸生物合成降低40%，同时使β氧化增加2倍，通过平衡醛缩酶A的表达，mir-122-5p还参与控制糖酵解的破坏。而miR- 210-5p可以在TCA的多个点发挥负作用，对TCA循环代谢产生重要影响[6]。

2.3 对线粒体膜电位的影响 在电子传递过程中, 伴随着质子从线粒体内膜的里层向外层转移, 形成跨膜的氢离子梯度,这种势能驱动了氧化磷酸化反应, 合成ATP。Lin等[7]利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库发现肝癌组织中miR-548b-3p的表达低于正常组织。miR-548b-3p模拟物和抑制剂分别转染Huh7和SK-Hep-1(HCC细胞系中的一个)细胞，发现miR-548b-3p模拟下调的线粒体膜电位，而miR-548b-3p抑制剂在SK-Hep-1细胞中显示相反的作用。miR-548b-3p通过直接靶向蛋白磷酸酶2A癌性抑制剂(CIP2A)下游靶蛋白c-myc基因发挥抑癌作用。CIP2A的消耗部分降低了miR-548b-3p模拟物/抑制剂对c-myc的影响。miR-548b-3p在HCC中被下调，而miR-548b-3p抑制剂上调了线粒体膜电位(MMP)。

2.4 对线粒体分裂/融合的影响 线粒体是动态的细胞器，其分裂和融合的平衡影响线粒体的形态，也帮助线粒体改变胞质定位，比如在需要大量ATP的组织积累，或Ca2+信号需要调节的地方积累。Mitofusin-2锚定在线粒体外膜上，参与线粒体分裂和融合。已经发现一些miRNA可以影响线粒体动力学[8]。①miR-761被发现通过靶向线粒体裂变因子抑制线粒体裂变和凋亡，miR-761对于维持线粒体分裂和融合之间的平衡以及细胞内稳态至关重要。Mitofusin-2是miR-761的直接靶点，它的过表达可通过触发内质网Ca2+流入线粒体而诱导HCC细胞凋亡。此外，miR-761抑制剂通过上调Mitofusin-2而损害线粒体功能，并在体内和体外抑制肿瘤生长和转移。②miR-30家族成员通过靶向线粒体裂变介质Drp-1.25调节细胞凋亡。③miR-140通过靶向Mitofusin-1促进线粒体裂变和凋亡。

3 miRNA对血管微环境的调节

恶性肿瘤的生长、渗透和转移需要血管生成，包括HCC[9]。作为一种重要的多功能血管生成因子，血管内皮生长因子(VEGF)通过专门作用于血管内皮细胞(ECs)表面的受体来发挥其作用，这不仅促进血管ECs的线粒体增殖和分化，而且提高了毛细血管渗透性。目前诸多研究发现miRNA对肿瘤微血管有双向调节作用。

3.1 miRNA对HCC血管生成的抑制作用 Ghosh等[10]发现在HCC组织中观察到miR-199a-3p的表达明显较低，并且其过表达显著抑制了小鼠体内的肿瘤生长和肺转移。miR-199a-3p通过干扰HSCs和CACs之间的血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、位于ECs上的VEGFR2分泌的促血管生成因子VEGFA，以及VEGFR2减弱的VEGF受体介导的下游信号血管生成素2之间的串扰和TME的基质成分抑制HCC的转移、侵袭和血管生成。此外，该miRNA对肝脏微环境中多个信号分子的沉默表明miR-199a-3p限制了HCC的转移、侵袭和血管生成。在人类HCC组织中，miR-26b的表达明显下调。miR-26b显著抑制磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt和核因子-κB(NF-κB)/MMP-9/VEGF通路，继而抑制细胞增殖，诱导凋亡以及增加肝癌细胞系Bax和caspase-3/9蛋白表达的作用[11]。miR-144-3p在HCC中经常被下调，可以通过PI3K独立信号通路调节糖皮质激素激酶3激活来抑制增殖、迁移和抑制血管生成，并作为HCC患者的预后因子[12]。

3.2 miRNA对HCC血管生成的促进作用 Tong等[13]证实miR-338-3p在HCC组织和HCC细胞系中均被抑制。细胞迁移侵袭试验和绒膜尿囊膜检测，表明miR-338-3p的下调可以急剧增加，而上调则可以显著抑制HCC细胞的血管生成。在HCC患者中，高miR-210表达与不良预后，无肿瘤生存期和总生存期显著相关。此外，HCC中miR-210的表达与微血管密度显著正相关，体内、外的研究均确定缺氧诱导的miR-210通过纤维母细胞生长因子(FGF)信号介导靶向调节成纤维细胞生长因子受体1(FGFRL1)表达和分泌促进HCC血管生成[14]。miR-195通过负调控，FGF2和VEGFA促进HCC的肺转移[15]。miR-520f通过调节FGF16的表达促进HCC侵袭性[16]。

4 miRNA对免疫微环境的调节

目前研究发现,miRNA对HCC的发生、分化、转移、凋亡等过程中免疫系统的影响主要分为促进免疫应答与抑制肿瘤的发生、发展以及逃避免疫监测，促进肿瘤发生与恶化两方面。

4.1 参与免疫抑制的miRNA Ponsuksili等[17]研究猪肝miRNA表达的遗传调节发现let-7家族mRNA的表达与血糖水平呈负相关，与红细胞呈正相关，与淋巴细胞计数呈负相关。它还调节白细胞介素-13(IL-13)表达，并抑制适应性免疫反应，促进肿瘤的免疫逃避。miR-146a的表达是由异常激活转录激活因子3(STAT3)在肝癌细胞和施加负面影响抗肿瘤免疫反应调节的,从而导致TGF-β、IL-17、VEGF等细胞因子上调，Ⅰ型γ-干扰素(IFN-γ)则下调，从而产生了免疫抑制性微环境[18]。miR-200c的过度表达直接针对CD274的3'非翻译区域(3′-UTR)，从而对抗乙型肝炎病毒(HBV)介导的PD-L1表达，并逆转抗病毒CD8+T细胞耗尽从而抑制了HBV逃避宿主免疫监测[19]。miR-362-3p可作为介导肿瘤相关巨噬细胞中TGF-β途径与肿瘤细胞中四聚体之间串扰的核心因子，从而促进上皮-间质转化过程[20]。

4.2 参与免疫应答的miRNA miR-19a-3p通过靶向抑制Fra-1并抑制其下游基因VEGF、STAT3和p-STAT3来抑制M2巨噬细胞的极化，进而抑制细胞免疫逃逸及HCC的恶变[21]。miR-26b-5p导致分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IFN-γ、IL-6和2在CD4+和CD8+细胞，且miR-26b-5p通过靶向HCC中的pim2增强T细胞应答，通过重新激活免疫系统来抑制HCC的发生[22]。miR-570可抑制HCC增殖、血管生成和免疫逃逸[23]。

5 miRNA对炎症微环境的调节

通过流行病学研究和实验模型收集的数据显示慢性炎症与各种类型的癌症之间的联系，使炎症在癌症发展中的作用已得到公认。大多数癌症组织表现出特定类型的炎症反应，并被认为是肿瘤发生的重要组成部分。在80%～90%的HCC患者中发现了HBV和丙型肝炎病毒(HCV)。HBV是一种带有双链环状DNA的包膜DNA病毒[24]。HBV整合到宿主基因组中，导致基因组不稳定。在大多数有HBV或HCV感染的HCC患者中都观察到肝硬化，一些信号通路将炎症和癌症联系起来，miRNA也在这些炎症信号通路[如 NF-κB 、肿瘤蛋白(TP53)、AQP5和Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信号通路]中被观察到，miRNA通过这些机制对HBV-HCC的过程产生不同的影响。

5.1 miRNA对JAK/STAT通路的影响 PI3Ks信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B所组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)诱导Il-6介导的STAT3信号转导miR-21的上调通常会在炎症纤维化轴的早期阻断肿瘤抑制因子(如PTEN和PDCD4)，并在HBV-HCC阶段继续[25]。miR-124 还通过直接靶向STAT3和PIK3来抑制体外和体内HCC模型中的细胞增殖和肿瘤生长，从而抑制JAK/STAT和PI3K/AKT通路[25]。HBx下调Let-7，后者也可通过未能调节炎症细胞因子的表达而激活STAT3信号，从而影响miRNA介导的关键肿瘤抑制因子的抑制[25]。

5.2 miRNA对AQP5通路的影响 水通道蛋白5(AQP5)高表达可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，重置细胞周期，促进上皮间质转化和细胞迁移。与HBV相关的Huh7-1.3(正常细胞)和HepG2.2.15(HBV-HCC细胞)细胞中AQP5 mRNA和蛋白表达水平高于Huh7和HepG2细胞，HCC细胞生长需要AQP5。而过表达miR-325-3p抑制了HBV抗原的分泌，包括HBeAg和HBsAg，以及病毒cccDNA复制和细胞增殖，促进Huh7-1.3和HepG2.2.15细胞的凋亡[26]。

5.3 miRNA对Wnt/β-catenin通路的影响 在早期HCC中，Wnt/β-catenin通路的上调是一种常见事件，它产生一种与癌细胞的增殖、迁移、侵袭和存活有关的侵袭表型。抑制miR-181可显著抑制肝肿瘤肝细胞(CSCs)的致瘤性，该miRNA通过激活包括caudal homeobox基因2和GATA6在内的转录因子，负调控Wnt/β-catenin通路，从而调控肝脏CSCs的分化潜能[27]。而HBx上调miR-155则阻断了WNT通路中的APC肿瘤抑制因子，并通过阻断增强子11抑制HBV复制，潜在地将病毒隐藏在宿主免疫系统之外[27]。

5.4 miRNA对NF-κB通路的影响 NF-κB信号通路是由细胞外的刺激引起的，NF-κB细胞对外界刺激以细胞的炎症反应、免疫应答等方式起到关键性作用。miR-127-5p通过直接与HCC细胞的胆绿素还原酶B(BLVRB)3′-UTR结合抑制NF-κB的活性，进而抑制HCC细胞的生长和集落形成，降低BLVRB的表达[28]。

6 总结

HCC肿瘤微环境极其复杂，笔者此次仅查阅了其中的部分内容，除上述外还有如miRNA对DNA甲基化、肿瘤的Warburg效应、端粒酶等的调节[29-31]。总之，目前HCC仍是严重威胁人类健康的恶性疾病,我国肝癌新发和死亡病例均占全球半数以上[32]，由于HCC具有极大的异质性、进展快、易转移的特点，虽然手术治疗是最佳的治疗方案，但根治切除率低且复发率高,而现在全球肝移植因技术及患者自身等因素，尚不能广泛开展。近年来广大学者对miRNA的深入研究涉及HCC的诊治、预后，与临床疗效密切相关，所以重视针对肿瘤微环境与miRNA的研究,有助于进一步提高HCC的临床疗效。