P2Y6在心血管疾病中的研究进展

张倩，胡庆华

(中国药科大学药学院，江苏 南京 211198)

嘌呤受体家族主要分为两类：P1腺苷类和P2核苷酸类，其中P2家族则分为两个亚家族：配体门控离子通道型受体(P2X受体)和G蛋白偶联受体(P2Y受体)。P2Y6受体的内源性配体是细胞外核苷酸分子，由二磷酸尿苷(UDP)选择性激活的。在生理状态下，细胞外核苷酸分子的浓度保持在很低的水平，而细胞内的浓度明显高于细胞内的浓度。然而，在炎症、损伤等病理条件下，细胞可将细胞内核苷酸释放到细胞外，通过自分泌、旁分泌等形式激活P2Y6受体，从而产生生物学效应[1]。研究表明，P2Y6可以通过调节细胞因子IL-8的表达来加剧炎症[2]。通过激活NF-κB加速破骨细胞的存活[3]；同时还参与单核细胞和T淋巴细胞的成熟与分化过程[4]；此外，P2Y6还具有调节血管炎症，参与心肌纤维化进程的功能，这些功能与心血管疾病的发生发展密切相关。不断深入的大量研究表明，P2Y6受体很有希望发展成为一个重要的药物靶标。

1 P2Y6R在CVD中作用

1.1 促进血管炎性病变发生 在正常情况下，ECs会抵抗动脉壁上白细胞的黏附和聚集[5]。在肿瘤坏死因子α或脂多糖的刺激下，血管内皮细胞上P2Y6R的表达被选择性地上调，而其他P2Y或P2X受体水平则保持不变。P2Y6R通过激活NF-KB途径，可以诱导白介素-8(IL-8)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)的表达，促进血管炎症的发生[6]；且有研究观察到在P2Y6R拮抗剂治疗下，人微血管内皮细胞中促炎基因表达减弱，且LPS诱导的血管炎症反应在P2Y6R 敲除的小鼠中明显降低[7]。P2Y6加速在过敏性哮喘或败血症等情况下白细胞募集和炎症，而由白细胞募集到血管壁驱动的慢性炎症恰好加剧动脉粥样硬化[8]。同时，P2Y6R可以增强巨噬细胞的促炎作用，并且促进造血细胞中的动脉粥样硬化发生，以及动脉瘤等血管性疾病的发生于发展[9]。巨噬细胞广泛表达P2Y成员，其中以P2Y6在巨噬细胞中高度表达，嘌呤受体P2Y6可以激活MEK1/2-ERK1/2-AP1信号通路，并明显增加巨噬细胞中MCP-1、IFN-α/β等的转录和表达，这些趋化因子可以改善体内单核细胞/巨噬细胞的募集，从而最终增强机体抵抗感染的能力，以及提高宿主存活率[10]。

1.2 介导VSMC收缩与增殖 在高血压的发病机制中起着重要作用的一环是血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖和凋亡。最近的研究表明，血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)可以引起人主动脉平滑肌细胞(HAVSMC)功能障碍，从而诱发或加重高血压[11]。嘌呤能受体P2Y6是炎症诱导的G蛋白偶联受体，可促进Ang Ⅱ诱导的高血压。研究表明miR-185通过直接结合P2Y6，负调控P2Y6表达和下游ERK途径抑制Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖，从而可以发挥治疗高血压的作用[12]。在小鼠中，P2Y6R的缺失可以削弱了Ang Ⅱ诱导的血压升高、血管重塑、氧化应激和内皮系统功能障碍[13]。Ⅰ型血管紧张素(Ang)受体(AT1R)促进了动脉壁的功能和结构完整性，从而有助于血管内稳态，但该受体也促进了高血压。P2Y6R以年龄依赖性方式促进了小鼠中血管紧张素Ⅰ型受体(AT1R)刺激的血管重塑，可能作为预防年龄相关性高血压的治疗靶标[14]。早前有研究发现P2X1、P2Y2、和P2Y6是血管平滑肌细胞表达最多的嘌呤能受体，能够介导了该细胞的收缩与增殖[15]。通过激活P2Y受体，刺激Ras-Raf-MEK-ERK1/2级联反应以促进VSMC的增殖[16]。Govindan等[17]进一步证明了P2Y6是加剧VSMC收缩和增殖的受体之一。

1.3 调节肌源性紧张度 肌源性紧张度(myogenic tone -MT)代表SMC的固有能力，而与神经体液或内皮输出无关，并且可确保动脉收缩以响应内部压力，该压力可在压力变化时调节血流，以确保恒定的器官灌注。MT异常与心血管疾病有关，包括慢性心力衰竭，高血压和心肌病[18-20]。阐明主要在小鼠抗性动脉中表达的P2Y6R仅对小鼠肠系膜抗性动脉的MT起作用。P2Y6R-/-小鼠对MT升高具有抗心肌梗死性心力衰竭的保护作用，这与脑实质小动脉的发现一致[21-22]。有人认为，P2Y6R的激活可能是通过RhoA-GTP结合，肌球蛋白轻链和c-Jun N末端激酶磷酸化介导的。这种机制可能会提供一种新的方案来削弱心血管疾病中的组织灌注，其中P2Y6R的特异性靶向可能是关键步骤。

1.4 促进心肌纤维化 高血压等压力负荷刺激，可以导致心肌细胞经过Pnx离子通道来释放ATP、UDP等核苷酸到胞外，进而刺激心肌细胞的P2Y6R，被受体偶联的Galpha(12/13)蛋白可以通过激活Rho通路，进一步调节如CTGF和TGF-β等纤维化因子的表达，从而达到促进下游Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的表达，加剧心肌纤维化的产生的目的[23]。心脏纤维化的特征在于细胞外基质蛋白的过度沉积，是心力衰竭的原因之一，导致心脏功能的损害。细胞外核苷酸刺激的P2Y6R激活心肌细胞中的Galpha(12/13)会触发压力超负荷引起的心脏纤维化，抑制P2Y6R则可以抑制纤维生成基因和心脏纤维化的表达[24]。P2Y6R的缺失增强了异丙肾上腺素注射后诱发的病理性心脏肥大。UDP可以抑制体外异丙肾上腺素诱导的心肌细胞增生和肥大[25]。然而最新研究表明，在新生心肌细胞中，P2Y6R的敲低显著减弱了由低渗刺激引起的肥大性生长和细胞死亡，表明P2Y6R参与了机械应激诱导的心肌功能障碍。出乎意料的是，与野生型小鼠相比，P2Y6R的缺失促进了压力超负荷引起的猝死以及心脏重塑和功能障碍。心肌细胞特异性过表达P2Y6R的小鼠也表现出心脏功能障碍和严重的纤维化。相反，P2Y6R缺失对阿霉素治疗引起的氧化应激介导的心脏功能障碍影响很小。尽管心肌细胞中的P2Y6R有助于心脏纤维化的进展，但P2Y6R的全身性抑制加剧了小鼠压力超负荷引起的心力衰竭[26]。P2Y6R可能构成调节心脏肥大的治疗靶标。

2 P2Y6R拮抗剂

迄今为止，已经基于一些化学支架和高通量筛选(HTS)测定法开发和评估了一系列P2Y6R拮抗剂，包括：二异硫氰酸盐、尿嘧啶核苷酸、TIM-38。尽管到目前为止已经开发和评估了几种P2Y6R拮抗剂，但没有一种已成功开发为治疗药物。因此，需要发现具有新颖骨架，高效力和选择性以及良好口服生物利用度的P2Y6R拮抗剂。在这项研究中，我们来介绍抑制人类P2Y6受体的相关化合物。

2.1 二异硫氰酸盐 在2004年，Mamedova等[27]研究发现，DIDS及其二氢衍生物：H2-DIDS能够抑制UDP诱导的大鼠P2Y6R的PLC活性。 两个异硫氰酸酯基团之一的取代会导致活性降低，表明两个异硫氰酸酯基团都是P2Y6R抑制活性所必需的。因此，进一步探索了芳基二异硫氰酸酯的SAR来鉴定P2Y6R的有效拮抗剂，从而发现了二异硫氰酸酯衍生物[28]。MRS2567、MRS2575和MRS2578被确定为有效的P2Y6R拮抗剂，其中MRS2578最有效，对人P2Y6R的IC50为(37±16)nmol·L-1，对于大鼠P2Y6R的IC50达到(98±11)nmol·L-1。 尽管，MRS2575仅抑制人P2Y6R活性，但却是目前使用最广泛的P2Y6R拮抗剂。

关于MRS2578抑制作用的相关研究有很多。MRS2578可以抑制痛风相关尿酸钠晶体诱导的嗜中性粒细胞活化以及NETs的形成[29]；通过促进促炎反应以及MMP表达和活性，MRS2578的给药可加剧实验性腹主动脉瘤(AAA)的进展和破裂[30]；MRS2578选择性抑制小胶质细胞吞噬作用可增加缺血性中风后的脑萎缩和水肿体积[31]；MRS2578还可以通过抑制ROCK途径调节C2C12成肌细胞的细胞骨架重组和细胞迁移[32]。

2.2 尿嘧啶核苷酸 与已发表的激动剂数量相比，尿嘧啶核苷酸激活的P2Y6R拮抗剂的开发化合物明显较少，但它们显示出更大的结构变异性。由于MRS2578在水溶液中的不可逆性，疏水性和有限的稳定性，研究人员旨在鉴定基于UDP支架的，具有良好选择性、可逆性、稳定性和水溶性的hP2Y6R拮抗剂。Meltzer等[33]建立了UDP类似物的结构-活性关系，在尿嘧啶环，核糖部分和磷酸链上进行了修饰。结果发现20-OH对于hP2Y6R的激动剂或拮抗剂活性至关重要，而hP2Y6R不容许UDP的3-N Me和C5-烷基/芳基修饰。硫酸盐基团取代UDP中的b-磷酸盐会降低激动剂活性，并导致拮抗剂活性。 5-F和5-OMe-UDP降低了激动剂活性，但是它们并未导致拮抗剂活性。通过进一步评估类似物对核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(NPP1/3)的水解的抗性，以筛选出合适的尿苷核苷酸类似物用作开发人P2Y6R拮抗剂的支架。

2.3 TIM-38 在1321N1人星形细胞瘤细胞中使用荧光成像板读数器来测量细胞内Ca2 +浓度([Ca2 +]i)的水平，并使用酶联免疫吸附法测定IL-8的浓度。在包含141700种化合物的化学文库中进行了HTS，鉴定出43种对P2Y6R具有抑制活性的化合物，新型的选择性P2Y6R抑制剂TIM-38脱颖而出[34]。使用剂量反应分析，受体选择性分析和趋化因子测量分析的进一步研究表明，选择性P2Y6R抑制剂TIM-38以剂量依赖的方式抑制UDP诱导的[Ca2 +]升高。TIM-38的IC50值为4.3 μmol·L-1，可抑制P2Y6，而不会影响其他4种人P2Y或毒蕈碱受体诱导的应答。此外，TIM-38以剂量依赖性方式抑制UDP诱导的白细胞介素8的释放，而不影响其他刺激物(如白细胞介素1β或肿瘤坏死因子-α)引起的释放。TIM-38衍生物的分析表明，硝基部分对P2Y6R的抑制至关重要[35]。TIM-38充当P2Y6R的新型结构拮抗剂，并且可能是开发靶向P2Y6R的抗炎药的良好先导化合物。

3 展望

综上所述，P2Y6R的过度激活将会导致严重的生理功能障碍与疾病。除了参与心血管疾病，P2Y6R在神经病、呼吸系统疾病和胃肠疾病的发生于发展中也起着重要作用[36-38]。其中，P2Y6R介导的细胞外核苷酸活动是参与心血管疾病发生和发展的最为重要的因素，主要表现为加重血管炎症，增加血管张力，促进平滑肌细胞的收缩和增殖等方面，所以寻找P2Y6R阻断剂的研究或能成为未来心血管疾病药物研究领域的一大热点。

为了进一步探索具有新颖有效的化学结构的P2Y6R拮抗剂，可以部分保留具有P2Y6R抑制活性的骨架，并用其他取代基取代。还可以通过HTS发现新的化合物，并在结构上进一步修饰所命中的化合物。总之，对P2Y6R拮抗剂的进一步修饰可以集中在提高化合物的稳定性和可逆性上，同时保持对P2Y6R的高亲和力和选择性。

P2Y6R广泛调节各种炎症因子和炎症反应的发生，并与其他受体，例如CysLTlR和C5aR等受体协同调节炎症细胞因子的表达[39]，为抗炎症药物的研究发展提供了新的靶点。另外，激活P2Y6R可以加速胰岛素的分泌，并且相应受体的激动剂和拮抗剂的发展有望成为治疗糖尿病的药物。 因此，深入研究P2Y6R的生物学作用具有非常重要的理论和实用价值。P2Y6R的生物学效应的未来研究应倾向于在阐明其生物学效应，以明确其在某一领域的应用价值。